摘要：利用響應面法，對香菇菌糠多糖（Lentinus edodes residues polysaccharides，LRPS）的提取條件進行優(yōu)化，利用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）等對其2種組分LRPS-1、LRPS-2進行化學結構特征分析，測定其抗氧化活性。結果表明，LRPS的最佳提取條件為：加水稀釋35倍、醇沉時間20 h、pH值為8，此時多糖的得率為3.69%；LRPS-1由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖組成，物質(zhì)量之比為1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0，LRPS-2由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖組成，物質(zhì)量之比為7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4；LRPS-1、LRPS-2均有較強的抗氧化活性，LRPS-2更為顯著。

關鍵詞：香菇；菌糠；響應面；提取優(yōu)化；多糖；抗氧化

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0325-04

收稿日期：2016-03-02

作者簡介：沙日娜（1982—），女，內(nèi)蒙古通遼人，碩士，講師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品檢驗研究。E-mail：15588894651@163.com。

香菇（Lentinus edodes）別稱花菇，為真菌門側耳科香菇屬世界第二大食用菌[1]。香菇口味鮮美，富含多糖、維生素、蛋白質(zhì)、多元酚、樸菇素、膳食纖維等多種生物活性物質(zhì)，其中，菌絲體多糖是香菇菌絲體中最重要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保肝護肝和降血糖等作用[2-4]。菌糠是真菌收獲后的培養(yǎng)基剩余物，含有豐富的菌絲體，我國年產(chǎn)各類菌糠總量約為900萬t，大部分被作為廢物遺棄，在浪費資源的同時造成環(huán)境污染。響應面法（RSM）是以最經(jīng)濟的方式、較少的試驗次數(shù)及較短的時間對參數(shù)進行全面研究，越來越多地被應用于各種生物化工處理過程[5]。本研究對香菇菌糠多糖的提取條件進行優(yōu)化，利用DEAE-52纖維素柱和葡聚糖G-100對香菇菌糠多糖（LRPS）進行分離純化，研究多糖組分LRPS-1、LRPS-2的分子量、單糖組成和抗氧化活性，從而為香菇菌糠的開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

香菇菌糠，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科學院真菌研究所提供。

1.2儀器與試劑

1.2.1試驗儀器752-N紫外可見分光光度計、DK-S24型恒溫水浴鍋、DZF-6021型真空干燥箱，均由上海精宏實驗設備有限公司生產(chǎn)；GC2010氣相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)；TDL-5-A型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)；Nicolet380 傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電集團生產(chǎn)；LXJ-68-02 型離心機，北京醫(yī)療儀器修理廠生產(chǎn)。

1.2.2試劑30% H2O2，天津市凱通化學試劑有限公司生產(chǎn)；95%乙醇，天津市百世化工有限公司生產(chǎn)；DPPH、DEAE-52纖維素、葡聚糖G-100，Sigma公司生產(chǎn)；苯酚，天津市天大化學試劑廠生產(chǎn)；濃硫酸、濃鹽酸，淄博化學試劑廠有限公司生產(chǎn)；三氯乙酸，天津大茂化學試劑廠生產(chǎn)。

1.3多糖的提取與測定

使用多功能粉碎機粉碎香菇菌糠，采用水提醇沉法[6-7]提取香菇菌糠多糖，采用苯酚-硫酸法[8]測定多糖含量。

1.4香菇菌糠多糖的提取優(yōu)化

1.4.1Plackett-Burman（PB）試驗設計采取9因素3水平PB試驗（表1）考察各提取條件對LRPS提取率的影響；采用Design-Expert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.4.2響應面（RSM）試驗設計根據(jù)PB試驗結果，選取pH值、加水倍數(shù)、醇沉時間這3個對多糖得率影響最大的因素進行響應面法優(yōu)化條件的篩選試驗，以1、0、-1編碼自變量的高、中、低3個水平，通過最小二乘法擬合二次多項方程，模型表達式為：y=A0+∑Aixi+∑Aiixi+∑Aijxixj。式中，y為響應值，即LRPS得率，A0、Ai、Aii、Aij為方程系數(shù)，xi、xj（i≠j）為自變量編碼值。采用Design-Expert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析。

1.5多糖的凝膠柱層析

采用DEAE-纖維素離子交換柱對多糖進行分離純化，采用葡聚糖G-100凝膠柱對多糖進行進一步分離純化和純度鑒定[9]，采用硫酸-苯酚法測定收集到的多糖溶液濃度，繪制洗脫曲線。

1.6多糖的化學結構分析

1.6.1單糖組成測定糖樣品經(jīng)過0.25 mol/L H2SO4 100 ℃ 加熱16 h完全水解，或者不經(jīng)過水解處理，按照Blakeney等的方法[10]將各單糖制備成全乙酰化糖醇衍生物；采用氣相色譜分析糖的構成，分離柱為島津公司生產(chǎn)的 0.25 mm×30 m毛細管柱DB-1，柱溫為210 ℃，N2流速為 30 mL/min。

1.6.2多糖分子量的測定多糖樣品溶于50 mmol/L的硝酸鈉溶液或0.05%疊氮化鈉中，獲得濃度為2.0 mg/mL的糖溶液；使用0.45 μm濾膜過濾，直接進樣[11]進行高效液相色譜測定，測定條件為：30 cm×4.6 mm TSKG3000PWxl色譜柱，3.5 cm×4.6 mm TSK保護柱，流動相為50 mmol/L硝酸鈉溶液或0.05%的疊氮化鈉，流速為0.4 mL/min，柱溫為 30 ℃，進樣量為20 μL。

1.7多糖抗氧化分析

多糖清除DPPH自由基的測定方法為：2 mL 95%乙醇或0.1 μmol/L DPPH，與2 mL濃度在100～1 000 mg/L之間的EPS溶液進行混合，25 ℃水浴15 min，517 nm處測定吸光度[12]。EPS清除羥基自由基的測定采用Smironff等的方法[13]，多糖還原力的測定采用Oyaizu的方法[14]。

2結果與分析

2.1PB試驗

由表2可見，當香菇菌糠加水稀釋20倍、pH值為5、提取溫度為95 ℃、提取時間為3 h、提取1次、乙醇濃度為95%、乙醇稀釋2倍、醇沉時間36 h、醇沉溫度12 ℃時（編號5），LRPS的得率相對最高，為3.34%。由表3可知，試驗模型的P值小于0.01，模型回歸性較好，能夠很好地反映變量和自變量之間的變化規(guī)律；pH值、加水倍數(shù)和醇沉時間的P值均小于0.01，這3個因素對LRPS的得率影響顯著，其他因素影響相對較小或不顯著。因此，選取提取pH值、加水倍數(shù)和醇沉時間這3個因素進行響應面分析試驗。

2.2RSM試驗

2.2.1選取優(yōu)化因素pH值、加水倍數(shù)、醇沉時間分別以變量x1、x2、x3表示，經(jīng)多重回歸分析，LRPS得率的預測值y和變量之間的多項式模型為：

y=2.11+0.30x1+0.14x2+0.31x3-0.12x1x2-0.067x1x3+0.10x2x3-0.42x12-0.30x22-0.27x32。

2.2.2響應面數(shù)據(jù)分析由表4可知，線性回歸系數(shù)x1、x3和[CM（25]二次項系數(shù)x12、x22、x32均極顯著（P<0.01），線性回歸系數(shù)x2顯著（P<0.05），這表明pH值、加水倍數(shù)和醇沉時間對LRPS得率的影響都比較顯著；模型的P值<0.000 1，具有極顯著性，而F值為13.40，這說明香菇菌糠多糖的預測值和試驗值一致；失擬項的F值為0.29，P值為0.128 9，這說明試驗結果并非由純誤差引起，模型方程適合對LRPS提取試驗的理論預測。另外，試驗結果表明，模型的R2值為0.999 6，這說明試驗值和預測值高度吻合，99.96%的響應值具有可變性；調(diào)整行列式系數(shù)的R2值為0.999 0，這說明 99.90% 的LRPS總變差歸因于獨立變量，僅約0.10%的總變量不能用模型解釋。

經(jīng)響應面（圖1）分析，提取條件為pH值7.88、加水34.5倍、醇沉時間19.82 h，LRPS的得率相對最高，為3.85%，而驗證試驗LRPS的得率為3.84%，這表明該模型適用于LRPS提取?？紤]到操作方便，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為pH值8、加水35倍、醇沉時間20 h，此時，LRPS的得率為3.69%。

2.3香菇菌糠多糖的組分分離純化

采用DEAE-纖維素柱對LRPS進行組分分離，分別利用蒸餾水和0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液作為流動相對LRPS進行洗脫，得到2個組分LRPS-1、LRPS-2；對分離得到的2個組分用葡聚糖G-100凝膠作進一步分離發(fā)現(xiàn)，LRPS-1、LRPS-2均分離得到1個單一的洗脫峰，這表明LRPS-1、LRPS-2均為純多糖（圖2）。

2.4多糖組分化學結構分析

2.4.1單糖組成分析由表5可知，LRPS-1的單糖組成主要包括鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖，其物質(zhì)量之比為 1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0；LRPS-2的單糖組成主要包括鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，其物質(zhì)量之比為7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4。

2.4.2分子量由表6可知，LRPS-1的數(shù)均分子量Mn為4.36×102，重均分子量Mw為2.97×104，多分散系數(shù)Mw/Mn為68.11；LRPS-2的數(shù)均分子量Mn為6.93×102，重均分子量Mw為1.18×105，多分散系數(shù)Mw/Mn為 170.27。

2.4.3多糖的抗氧化活性由圖3可知，LRPS、LPS（香菇多糖）、LRPS-1、LRPS-2在波長700 nm處測得的吸光度分別為0.204±0.03、0.264±0.001、0.773±0.05、0.986±0.03；濃度為1 000 mg/L時，LRPS、LPS、LRPS-1、LRPS-2對DPPH 的清除率分別為（19.92±0.02）%、（39.88±0.01）%、（53.56±0.03）%、（55.61±0.01）%；對羥基自由基的清除率分別為（58.99±1.03）%、（66.20±1.34）%、（78.58±2.33）%、（92.10±2.57）%。由此可見，同等濃度下，LRPS的抗氧化活性略低于LPS，但是LRPS-1、LRPS-2的抗氧化活性明顯高于LPS，濃度為1 000 mg/L時，LRPS-2的還原力是LPS的3.73倍，對DPPH和羥基自由基的清除率均為LPS的1.39倍。

3結論

香菇菌糠多糖的最佳提取條件：pH值為8、加水35倍、醇沉時間為20 h，此時多糖的提取率為3.69%。對LRPS進行[CM（25]分離純化，得到LRPS-1、LRPS-2這2種組分，LRPS-1[CM）]由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖組成，物質(zhì)量之比為 1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0；LRPS-2由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖組成，物質(zhì)量之比為7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4。本試驗選取多糖對羥基自由基清除率、DPPH清除率及還原力3個指標考察多糖體外的抗氧化活性，結果顯示，LRPS-1、LRPS-2對DPPH、羥基自由基均有較強的清除能力及較強的還原力，LRPS-2的體外抗氧化活性相對更強。

[TPSRN3.tif]

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