裔傳燈++李瑋++王德榮++蔣偉++王穎++周勇++梁國華++顧銘洪

摘要：籽粒的大小和形狀是影響水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的主要性狀。在基因GS3序列分析的基礎(chǔ)上，對該基因第2外顯子A/C和第5外顯子13 bp Indel的2個變異位點分別開發(fā)功能標記，并將其用于294份水稻微核心種質(zhì)和2007—2013年江蘇省審定的65份粳稻品種的基因型鑒定。研究結(jié)果表明，第2外顯子的A/C變異在秈粳亞種中有著相似的分布頻率，并且都對粒長、粒厚和長寬比有極顯著的影響。相對于基因型C而言，基因型A在秈粳亞種中都有更長的粒長、更薄的粒厚和更大的長寬比。但是第5外顯子的13 bp 缺失變異只在粳稻中極低頻率（074%）出現(xiàn)，屬于稀有變異類型，比13 bp插入變異有著更短的粒長和更小的長寬比。這些研究結(jié)果為水稻產(chǎn)量和品質(zhì)育種中充分利用基因GS3的優(yōu)異等位基因奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；粒形；基因GS3；功能標記；變異

中圖分類號： S511.032文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0064-04

收稿日期：2016-04-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：31571624、31071382）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（編號：2010CB125904、2013CBA01405）；江蘇省高校自然科學研究重大項目（編號：15KJA210004）；揚州大學大學生學術(shù)科技創(chuàng)新基金（編號：x2015616）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目。

通信作者簡介：裔傳燈（1973—），男，江蘇鹽城人，博士，副教授，主要從事水稻遺傳育種研究。Tel：（0514）87937619；E-mail：cdyi@yzu.edu.cn。

由于人口數(shù)量持續(xù)增長、耕地面積日益減少、自然災害頻發(fā)和水資源不足等原因，水稻育種研究者不斷致力于提高水稻產(chǎn)量水平，確保國家的糧食安全。同時隨著生活水平的不斷提高，稻米消費者對稻米品質(zhì)也提出了更高的要求。水稻的產(chǎn)量和稻米品質(zhì)都是受多因素控制的復雜性狀[1-2]，其中粒形是影響水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的重要因素之一[3]。在目前已經(jīng)克隆的水稻基因中，通過調(diào)節(jié)粒形提高水稻產(chǎn)量的基因有GS3[4]、qPE9-1[5]、GW2[6]、 qGL3/GL3.1[7- 8]、qSW5/GW5[9-10]、GS5[11]、GS6[12]、GW7[1]、GW8[3]、SLG7[13]和TGW6[14]；通過調(diào)節(jié)粒形改善稻米品質(zhì)的基因有GW7[1]和GW8[3]。因此粒形性狀調(diào)控機理的研究對水稻的產(chǎn)量育種和品質(zhì)育種有著重要的參考價值。

GS3是控制水稻粒形的重要基因。Fan等研究發(fā)現(xiàn)基因GS3是控制水稻粒長和粒質(zhì)量的負調(diào)控因子，以短粒水稻品種川7基因GS3的基因組序列DQ355996為參照，來自長粒水稻品種明恢63的第2外顯子1 670 bp處的A堿基變異是無義突變，導致目標蛋白C端截短了178個氨基酸[4]。結(jié)合180個水稻品種的關(guān)聯(lián)分析，F(xiàn)an等進一步證實在秈粳亞種中基因型A比C都有更大的平均粒長[15]。除此變異外，Wang等還發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子的（AT）n變異和第5外顯子的（TCC）n變異也與水稻的粒長有關(guān)[16]。目前該基因還有哪些變異位點以及它們對水稻粒形性狀效應還不清楚。

為了加快基因GS3有利等位變異在水稻育種工作中的應用，本研究在序列比對的基礎(chǔ)上，對第2外顯子已知的功能變異和第5外顯子未知功能的錯義突變開發(fā)了相應的功能標記，結(jié)合水稻微核心種質(zhì)和近年來江蘇省審定粳稻品種的基因型檢測，分析了這些變異位點對水稻粒形性狀的影響，為我國尤其是江蘇省的水稻產(chǎn)量和品質(zhì)育種提供理論依據(jù)和快捷的選擇手段。

1材料與方法

1.1供試材料

本研究的供試水稻材料包括秈稻品種明恢63、粳稻品種日本晴和蘇粳2號、從中國農(nóng)業(yè)大學引進的294份水稻微核心種質(zhì)和從江蘇省農(nóng)業(yè)科學研究院引進的65份江蘇省在2007—2013年期間審定的粳稻品種[17]。水稻微核心種質(zhì)包含96份國外栽培稻品種和198份中國栽培稻品種[18]，具有豐富的遺傳多樣性。供試材料來自國內(nèi)外不同稻作區(qū)的水稻品種，它們的感光性存在較大的差異。為了確保能夠正常抽穗，所有供試水稻品種2014年11月于海南省陵水縣播種和育苗，2015年1月移栽大田，田間管理同于常規(guī)水稻品種。待水稻籽粒完全成熟后收種，曬干后進行水稻籽粒相關(guān)性狀的測量。

1.2水稻成熟種子粒形相關(guān)性狀數(shù)據(jù)的測定

參照《水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》的方法，水稻種子收獲并風干后，挑選飽滿成熟種子使用游標卡尺（精確到0.01 mm）測量粒長、粒寬和粒厚，5次重復，計算平均值。千粒質(zhì)量使用電子天平測定1 000粒成熟烘干種子的質(zhì)量，3次重復，計算平均值。

1.3基因GS3序列變異的分析和功能標記的設(shè)計

根據(jù)水稻粒形基因GS3的研究結(jié)果，從Rice genome annotation project網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）下載GS3基因的基因組DNA序列DQ355996。以該序列為種子序列，在NCBI網(wǎng)站核酸序列數(shù)據(jù)庫中找到高度同源的3個基因組DNA序列（來自秈稻品種9311的基因GS3序列Ctg009226、來自粳稻品種日本睛的基因GS3序列AB488612和來自粳稻品系H343的基因GS3序列AB743895[19]）和1個來自廣陸矮4號的cDNA序列（CT835094）。借助BioEdit軟件對上述序列進行比對分析。

本研究利用Primer Premier 5.0 軟件，對基因GS3的第2外顯子A/C序列點突變和第5外顯子的13 bp Indel的序列變異分別設(shè)計了CAPs標記GS3-1和GS3-2。引物的合成和序列的測定在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4DNA提取

收集供試材料分蘗盛期新鮮幼嫩的葉片，采用CTAB法[20]提取水稻基因組DNA。

1.5PCR擴增、酶切和電泳

[JP2]PCR反應體系含50 ng/ μL基因組DNA 2.0 μL，2 μmol/L引物F和R各2.5 μL，10×緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶（TaKaRa Code：R001C） 0.2 μL，滅菌雙蒸餾水補足至20 μL。PCR反應在Eppendorf Master cycler proS PCR儀上進行，反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。反應產(chǎn)物在3.0%的瓊脂糖上分離電泳。

利用PCR引物擴增基因GS3的目標片段，進一步用于酶切反應。酶切反應體系為10 μL，分別包含PCR反應產(chǎn)物 5 μL，10×buffer 1 μL，10 U/μL酶0.25 μL，ddH2O 3.75 μL?；靹蚝笾糜?7 ℃恒溫水浴鍋酶切3～4 h，酶切產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖上電泳，EB染色，經(jīng)紫外凝膠成相系統(tǒng)成像。

1.6數(shù)據(jù)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)的分析和處理利用Excel和SPSS軟件進行。

2結(jié)果與分析

2.1基因序列分析和分子標記設(shè)計

序列比對分析結(jié)果表明，基因GS3包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼區(qū)有59處序列變異，其中57個變異發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)。除了Fan等已報道位于第2外顯子區(qū)的A/C變異與該基因功能密切相關(guān)外，筆者發(fā)現(xiàn)該基因的第5外顯子還有1個13 bp的Indel變異位點[4]。以基因GS3的編碼序列DQ355996為參照，本研究對基因GS3第2外顯子第 1 670 bp 處的A/C錯義突變和第5外顯子第5 354 bp處的13 bp Indel變異分別開發(fā)了CAPs標記GS3-1和GS3-2（表1）。

對于基因GS3第2外顯子第1 670 bp處的A/C單堿基變異，筆者利用分子標記GS3-1能夠在水稻品種中擴增出長度為216 bp的PCR產(chǎn)物（如圖1-A的泳道1和2），經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切后，能夠被切成160 bp條帶的水稻品種日本睛基因型為C（如圖1-A的泳道4）；PCR產(chǎn)物仍為216 bp的水稻品種明恢63基因型為A（如圖1-A的泳道3）。

對于基因GS3第5外顯子第5 354 bp處的13 bp Indel變異，利用標記GS3-2能夠在水稻品種中擴增出長度為 224 bp 或211 bp的2種類型PCR產(chǎn)物（如圖1-B的泳道1和2）。由于這2種PCR產(chǎn)物片段差異較小，無法用普通瓊脂糖電泳加以區(qū)別；但是通過限制性內(nèi)切酶NaeⅠ酶切處理后，224 bp 的PCR產(chǎn)物能夠被切成176 bp條帶的水稻品種日本睛基因型為13 bp的插入型（如圖1-B的泳道3）；PCR產(chǎn)物仍為211 bp的水稻品種蘇粳2號基因型為13 bp的缺失型（如圖1-B的泳道4）。

[FK（W12][TPYCD1.tif]

2.2基因GS3不同變異位點對水稻粒形的影響

為了探明基因GS3第2和第5外顯子的2個序列變異位點對水稻籽粒相關(guān)性狀的影響，筆者利用上述發(fā)展的分子標記[CM（25]GS3-1和GS3-2分別對294份水稻微核心種質(zhì)的基因[CM）]

型進行了測定，并對每個位點的不同變異類型進行了t測驗，結(jié)果列于表2。

從表2中可以看出，在基因GS3第2外顯子的A/C序列變異中，不論秈稻還是粳稻，相對于基因型C而言，基因型A對增加粒長、減小粒厚、提高長寬比都有著極顯著的影響。在秈稻群體中，筆者還發(fā)現(xiàn)基因型A有極顯著減小粒寬的效應。對基因GS3第5外顯子13 bp的Indel序列進行變異，在粳稻群體中，筆者發(fā)現(xiàn)具有13 bp插入的基因型對增加粒長和提高長寬比有著極顯著的影響，但在秈稻群體中沒有發(fā)現(xiàn)13 bp缺失的基因型。

從基因型分布頻率來看，在基因GS3第2外顯子的A/C變異中，基因型A的頻率在秈稻品種中為27.85%，在粳稻品種中為23.53%，表明這種長粒形的基因型在秈稻和粳稻中都已經(jīng)被育種研究者加以應用。但是對于基因GS3第5外顯子的13 bp Indel變異而言，在136個粳稻品種中，筆者發(fā)現(xiàn)1個品種具有13 bp缺失的基因型，其分布頻率為074%，而在158個秈稻品種中沒有發(fā)現(xiàn)該基因型，表明13 bp缺失的基因型為稀有基因型。

另外筆者發(fā)現(xiàn)基因GS3第2和第5外顯子的2個變異位點對水稻千粒質(zhì)量的影響都沒有達到顯著水平。

2.3近年來江蘇省育成品種中基因GS3的基因型分析

為了更好地指導育種研究者在水稻育種中對籽粒相關(guān)性狀的選擇，本研究對2007—2013年江蘇省審定的65個粳稻品種基因GS3的2個目標變異位點進行了基因型測定，結(jié)果列于表3。在基因GS3第5外顯子的13 bp Indel變異中，65個粳稻品種都是基因型為13 bp插入類型。在基因GS3第2外顯子的A/C變異中，近年來江蘇省審定的粳稻品種內(nèi)，4個水稻品種的基因型為A；其余61個水稻品種的基因型為C，t測驗結(jié)果表明基因型A有極顯著增加粒長和提高長寬比的效應，這表明江蘇省水稻育種研究者已經(jīng)將長?；蛐蛻玫疆斍暗木居N實踐中。

[FK（W6][HT6H][JZ]表3近年來江蘇省審定水稻品種基因[WTHX][STHX]GS3[WTHZ]不同基因型的籽粒粒形性狀[HTSS]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK5。2，WK10。5W]基因型樣本數(shù)粒長（mm）粒寬（mm）粒厚（mm）長寬比千粒質(zhì)量（g）

[BHDG1*2，WK5，WK5，WK10。5DWW]A47.99±0.19*[KG-*3]*3.34±0.082.33±0.062.41±0.12*[KG-*3]*28.74±1.46

[BHDW]C617.36±0.043.38±0.022.38±0.012.18±0.0227.34±0.23[BG）F]

注：“*[KG-*3]*”表示差異極顯著（P<0.01）；表中籽粒相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤。

3討論與結(jié)論

籽粒是水稻光合產(chǎn)物貯存的主要目標器官。調(diào)節(jié)籽粒的大小和形狀（即粒形），增大光合產(chǎn)物的庫容量，對于提高水稻產(chǎn)量（尤其是產(chǎn)量的構(gòu)成因子千粒質(zhì)量）有著重要的作用。Mao等研究發(fā)現(xiàn)，以基因型為gs3的水稻品種明恢63為受體親本，互補和過表達試驗都能使粒長變短，粒質(zhì)量下降；而以基因型為GS3的水稻品種川7為受體親本，RNA干擾試驗使粒長變長，粒質(zhì)量增加[21]。但是在本研究中筆者利用水稻品種的自然群體（水稻微核心種質(zhì)）分析了基因GS3第2和第5外顯子的2個功能變異位點對水稻粒形的效應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2外顯子的A/C變異對水稻的粒長、粒厚和長寬比有著極顯著的影響，第5外顯子的13 bp Indel變異對粒長和長寬比有極顯著的影響，但是這2個變異位點對千粒質(zhì)量的影響沒有達到顯著水平，這可能是由于水稻的千粒質(zhì)量與粒形有著不同的遺傳控制系統(tǒng)，在遺傳背景復雜的水稻微核心種質(zhì)中，無法準確檢測到基因GS3對水稻千粒質(zhì)量的效應。

隨著水稻分子生物學的進展，雖然許多與水稻產(chǎn)量相關(guān)的重要功能粒形基因已被克隆[1，3-4，7-14]，但是這些基因還很少在水稻育種工作中得以利用，其原因主要有這些基因缺乏開發(fā)成本低廉且簡便實用的基因功能標記、這些基因等位變異類型未知、各等位變異類型的效應如何不清楚等等。利用關(guān)聯(lián)分析和轉(zhuǎn)基因的方法，F(xiàn)an等證實了基因GS3第2外顯子的A/C變異對水稻粒長和粒質(zhì)量有著重要的影響，并開發(fā)了相應的功能標記SF28[15，21]。本研究開發(fā)的CAPs標記 GS3-1 也是基于該A/C變異的另一個功能標記，酶切前后的條帶大小差異更大，易于鑒別。另外筆者還對基因GS3第5外顯子的稀有變異（13 bp Indel變異）開發(fā)了功能標記 GS3-2。利用標記GS3-2和限制性內(nèi)切酶NaeⅠ配合使用，將原來差異較小的224 bp和211 bp DNA片段，分別轉(zhuǎn)變成易于鑒別的176 bp和211 bp片段，可以直接使用普通瓊脂糖水平電泳加以分離和識別，為構(gòu)建該變異位點的水稻近等基因系和水稻育種中的分子標記輔助選擇提供了準確快捷的選擇方法。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)大學李自超教授和張洪亮博士提供的水稻微核心種質(zhì)；感謝江蘇省農(nóng)業(yè)科學院王軍博士提供的2007—2013年江蘇省審定的粳稻品種，這些水稻品種為本研究中分子標記的篩選和基因型的鑒定提供了便利。

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