王輝++董盼盼+李文麗++王富

摘要：以番茄黃化曲葉病毒病（tomato yellow leaf curf virus，簡(jiǎn)稱TYLCD）抗病純合基因型（Ty-3/Ty-3）材料A45、感病純合基因型（ty-3/ty-3）材料A39及其構(gòu)建的F2代分離群體（145個(gè)單株）為試驗(yàn)材料，采用接種鑒定的方法，同時(shí)進(jìn)行TYLCV抗性遺傳分析，比較P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19等3個(gè)標(biāo)記與Ty-3基因的連鎖程度。結(jié)果顯示，番茄黃化曲葉病毒病抗性遺傳符合1對(duì)顯性基因控制；P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19等3個(gè)標(biāo)記與抗病基因Ty-3間的遺傳距離分別為15.2、14.5、10.3 cM；利用分子標(biāo)記UF_TY3-P19可提高黃化曲葉病毒病抗性材料的效率。

關(guān)鍵詞：番茄；黃化曲葉病毒?。籘y-3基因；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)： S436.412.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0071-03

收稿日期：2015-10-12

基金項(xiàng)目：山東省良種工程農(nóng)業(yè)生物資源創(chuàng)新利用研究項(xiàng)目（編號(hào)：PTBR2013）；青島市民生計(jì)劃（編號(hào)：13-1-3-3-nsh）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：SDAIT-02-022-02）；山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2010CM047、ZR2014CQ034）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（編號(hào)：663-1115041）。

作者簡(jiǎn)介：王輝（1981—），男，山東鄆城人，博士，主要從事蔬菜遺傳育種及生物技術(shù)研究。E-mail：fromstick@163.com。

通信作者：王富，博士，教授，研究方向?yàn)榉堰z傳育種及生物技術(shù)。E-mail：wangfuabcd@163.com。

番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡(jiǎn)稱TYLCV）是侵染番茄的重要病毒之一，近年來因其在番茄上的廣泛流行而受到人們的關(guān)注。傳統(tǒng)的番茄抗TYLCV育種受到時(shí)間、環(huán)境等的限制，缺乏快速的檢測(cè)鑒定方法。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)輔助育種被廣泛應(yīng)用，相對(duì)于傳統(tǒng)育種，分子標(biāo)記輔助育種可以縮短育種周期，并且可以從分子水平找到相關(guān)抗性基因和相關(guān)位點(diǎn)。因此，研究挖掘利用有效的分子標(biāo)記，對(duì)相關(guān)育種工作具有重要意義。

番茄抗TYLCV植株材料先后在細(xì)葉番茄（Solanum pimpinellifolium）、秘魯番茄（Solanum peruvianum）、智利番茄（Solanum chilense）、多毛番茄（Solanum habrochaite）、契斯曼尼番茄（Solanum cheesmaniae）等野生材料中發(fā)現(xiàn)?？乖床牧喜煌?，其抗性遺傳規(guī)律也不同。目前已發(fā)現(xiàn)的抗性基因主要有 Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4、Ty-5[1-7]。Ty-3抗性基因最早的報(bào)道是在2007年，Ji等通過易感番茄品種7781x抗病自交系021108（Lycopersicon chilense LA2779）、易感番茄品種8248X抗病自交系034611（Lycopersicon chilense LA1932）雜交獲得的F2代分離群體進(jìn)行連鎖分析及QTL定位分析[4]，確定Ty-3抗性基因位點(diǎn)位于番茄6號(hào)染色體長(zhǎng)臂的Cleg-31-P16 （20cM）、T1079 （27cM）之間。隨著研究工作的開展，Ty-3基因位點(diǎn)被進(jìn)一步精確定位，Ty-3基因被定為在標(biāo)記UF_TY3-P1、UF_TY3-P23之間，約71 kb間隔內(nèi)[8-9]。在最新研究中，Ty-1、Ty-3是等位基因并且同時(shí)編碼1個(gè)未知功能的依賴RNA的RNA聚合酶。

本研究中，利用抗病品種A45（Ty-3/Ty-3）、感病品種A39（ty-3/ty-3）分別作為父、母本，獲得F1、F2代，通過接種鑒定的方法研究抗性基因Ty-3的遺傳規(guī)律，并通過2種較為成熟的分子標(biāo)記方法，即穩(wěn)定性較高的序列特異性擴(kuò)增區(qū)（sequence characterized amplified regions，簡(jiǎn)稱SCAR）標(biāo)記技術(shù)和多態(tài)性較好的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（cleaved amplified polymorphism sequences，簡(jiǎn)稱CAPS）標(biāo)記技術(shù)，對(duì)該抗性基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，確定穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、不易受環(huán)境影響的分子標(biāo)記，以期為抗番茄黃化曲葉病毒病育種工作奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

番茄抗病純合基因型（Ty-3/Ty-3）材料A45（P1）、感病純合基因型（ty-3/ty-3）材料A39（P2）來源于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，雜交后獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代群體。PCR酶切試驗(yàn)所用試劑（限制性內(nèi)切酶AluⅠ、內(nèi)切酶Buffer等）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1番茄TYLCV接種鑒定番茄材料播種育苗后，采用農(nóng)桿菌接種法對(duì)番茄葉片進(jìn)行TYLCV接種，接種所需的番茄黃化曲葉病毒農(nóng)桿菌菌株（GV3101 pCAMBIA0390_TY-19mer）由韓國(guó)釜山大學(xué)Young-su Seo教授惠贈(zèng)。根據(jù)Lapidot等的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10-11]發(fā)展而來的番茄黃化曲葉病毒病癥鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)番茄黃化曲葉病毒病癥狀進(jìn)行鑒定，病情2級(jí)以上為感病。

1.2.2分子標(biāo)記對(duì)番茄TYLCV的抗性檢測(cè)使用CTAB法提取采集的番茄葉片基因組DNA，檢測(cè)質(zhì)量后將濃度稀釋到20 ng/μL，用于PCR檢測(cè)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道[7，9]，選取與抗病基因Ty-3緊密相連且表達(dá)穩(wěn)定的分子標(biāo)記（SCAR標(biāo)記P6-25、UF_TY3-P19，CAPS標(biāo)記UF_TY3-P23），用于檢測(cè)番茄群體材料抗性，詳見表1。

PCR反應(yīng)體系：100 ng DNA，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol/L的dNTPs，各1.0 μL 10 μmol/L上下游引物，0.3 μL Taq聚合酶 （TaKaRa），用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。酶切反應(yīng)體系：5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1.5 μL CutSmart buffer，0.2 μL內(nèi)切酶 （TaKaRa），用ddH2O補(bǔ)足至15 μL。酶切在PCR儀或者水浴鍋中進(jìn)行，于37 ℃酶切1 h。取約10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，用Bio-RAD自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察照相，記錄電泳結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1番茄群體抗TYLCV表現(xiàn)型分析

在接種18 d后對(duì)P1（5株）、P2（5株）、F1（10株）、F2（145株）進(jìn)行病情發(fā)病情況調(diào)查，初步觀察后發(fā)現(xiàn)，TY抗病植株不表現(xiàn)病狀，感病植株表現(xiàn)出上部新葉黃化、葉片邊緣開始卷曲、葉片變小等癥狀。對(duì)群體植株調(diào)查后結(jié)果顯示，P2植株全部表現(xiàn)為感病，P1、F1植株表現(xiàn)為抗病，F(xiàn)2抗病植株、感病植株比為102 ∶[KG-*3]43（2.37 ∶[KG-*3]1）；通過卡方檢驗(yàn)可知，F(xiàn)2群體的χ2=1.811，P值=0.178 4，表明該性狀符合3 ∶[KG-*3]1的分離比例（表2）。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律推測(cè)，該遺傳群體對(duì)于TYLCV的抗性是由顯性單基因控制的。

2.2番茄群體抗TYLCV基因型分析

利用與Ty-3基因緊密連鎖的分子標(biāo)記P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19對(duì)F2代群體的單株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其Ty-3抗性。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，SCAR標(biāo)記P6-25、UF_TY3-P19在PCR后可以清晰地區(qū)分Ty-3純合抗病、雜合抗病、抗病，且P6-25在F2代群體的基因型比為20 ∶[KG-*3]95 ∶[KG-*3]30，UF_TY3-P19在F2代群體的基因型比為24 ∶[KG-*3]84 ∶[KG-*3]37（圖1、圖2）；對(duì)CAPS標(biāo)記 UF_TY3-P23 的PCR產(chǎn)物經(jīng)AluⅠ酶切后發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物在純合抗性材料中，無法酶切，只有1個(gè)特異性片段，感病材料被酶切成2個(gè)特異性片段，UF_TY3-P23在F2代群體的基因型比為 30 ∶[KG-*3]84 ∶[KG-*3]31（圖3）。

2.3番茄群體抗TYLCV基因型與表型對(duì)比分析

[CM（24]145株F2代植株通過與Ty-3緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)[CM）]

[FK（W8][TPWH3.tif]

行抗性檢測(cè)，如果將分子標(biāo)記檢測(cè)的雜合抗性材料視為抗病植株，綜合接種鑒定后結(jié)果對(duì)比分析表明，3個(gè)分子標(biāo)記與Ty-3存在一定的遺傳距離（表3）。通過對(duì)F2代群體的遺傳分析發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19與番茄抗黃化曲葉病基因的Ty-3間的連鎖距離分別是15.2、145、10.1 cM；標(biāo)記UF_TY3-P23、UF_TY3-P19比P6-25更靠近Ty-3，因此可以推測(cè)，在檢測(cè)番茄Ty-3抗性結(jié)果[JP3]時(shí)，標(biāo)記UF_TY3-P19比UF_TY3-P23、P6-25更具有準(zhǔn)確性。

3小結(jié)與討論

番茄TYLCV抗性育種，離不開抗病性鑒定。本試驗(yàn)的TYLCV抗病性鑒定采用農(nóng)桿菌注射法，在番茄苗期進(jìn)行簡(jiǎn)單快速的鑒定。與嫁接法、煙粉虱傳毒等方法相比，本方法簡(jiǎn)單易行，不受季節(jié)、煙粉虱密度、植株材料等因素的影響[12]，但是保證該方法順利進(jìn)行的前提是準(zhǔn)備TYLCV克隆的農(nóng)桿菌菌種，而對(duì)TYLCV進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化需要大量的時(shí)間。另外，對(duì)含有TYLCV的農(nóng)桿菌接種時(shí)，除了本試驗(yàn)中采取壓力法通過不帶針頭的注射器將接種液壓入番茄葉片背面，還可以利用帶針頭的注射器在番茄植株近根處的韌皮部部位進(jìn)行注射接種[13]，但是直接注射的接種液量少，不如壓力法接種充分。

在對(duì)接種TYLCV植株進(jìn)行病情鑒定時(shí)，通過植株的癥狀

表現(xiàn)來確定是否染毒，不表現(xiàn)TYLCV癥狀的植株是抗性植株。由于目測(cè)癥狀具有一定的不確定性。因此，在本試驗(yàn)中檢測(cè)的分子標(biāo)記與抗性基因的遺傳距離，與前人研究有一定差異。其主要原因?yàn)楸驹囼?yàn)將Ty-3基因進(jìn)一步定位，進(jìn)一步完善了Ji等的研究[7-9]；另外，本研究只對(duì)145株F2代群體進(jìn)行研究，樣品數(shù)量不夠大，接種后番茄植株是采取生物學(xué)鑒定的方法進(jìn)行病情調(diào)查的，此方法簡(jiǎn)單快捷，但是容易受到個(gè)人主觀感覺的干擾，也有可能影響接種鑒定結(jié)果。

本研究使用的標(biāo)記（P6-25、UF_TY3-P23、UF_TY3-P19）與Ty-3基因均存在一定的遺傳距離，但與P6-25相比，UF_TY3-P23、UF_TY3-P19這2個(gè)標(biāo)記與Ty-3間存在更緊密的連鎖關(guān)系，因此這2個(gè)標(biāo)記，尤其是UF_TY3-P19用于篩選抗TYLCV的番茄種質(zhì)資源效率更高。

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