徐志偉 趙杰++劉偉忠 劉照亭 王期

摘要：將hAPOA1的閱讀框連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建成正確的pGEX-4T-1-hAPOA1原核表達(dá)質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)入宿主菌BL21，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后，宿主菌表達(dá)出與預(yù)期分子量大小相符的55.4 ku的融合蛋白；將純化后的包涵體融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備抗hAPOA1血清并檢測抗體效價。結(jié)果表明，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附測定（ID-ELISA）及蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）方法證實，獲得的融合蛋白免疫新西蘭大白兔得到了特異性的多克隆抗體，抗體效價為1 ∶[KG-*3]40 000，經(jīng)濟(jì)效益可觀。

關(guān)鍵詞：hAPOA1；原核表達(dá)；新西蘭大白兔；融合表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號： S852.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0085-03

收稿日期：2016-08-11

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（16）1326]。

作者簡介：徐志偉（1965—），男，江蘇常州人，碩士，助理研究員，主要從事畜禽養(yǎng)殖研究。E-mail：xzw1729@sina.com。

通信作者：王期，博士，主要從事生物技術(shù)研究。E-mail：swwq0401@163.com。

載脂蛋白A1（ApoA1）是apoA族最多的一種組分，apoA1為單一多肽鏈，由243個氨基酸殘基組成，是高密度脂蛋白（HDL）的主要載脂蛋白，不僅是生物試劑的重要原料，也是抗動脈粥樣硬化的指標(biāo)[1]。目前，apoA1的檢測多采用免疫比濁法[2]，現(xiàn)有的抗載脂蛋白A1抗體的生產(chǎn)采用傳統(tǒng)的免疫方式（免疫原從高密度脂蛋白純化得到，免疫動物受限等），產(chǎn)量、效價及特異性較差，已無法滿足日益增長的使用需求。本研究構(gòu)建了hAPOA1的原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行hAPOA1的蛋白表達(dá)與純化，并通過免疫新西蘭大白兔獲得了抗血清，為自主大規(guī)模生產(chǎn)抗hAPOA1抗體及后續(xù)的免疫檢測試劑盒研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種和質(zhì)粒E.coli DH5α、表達(dá)載體pGEX-4T-1、E.coli BL21（DE3）均由筆者所在實驗室保存。

1.1.2試劑限制性內(nèi)切酶NotⅠ、EcoRⅠ為TaKaRa公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、核酸標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自MBI公司；蛋白胨和酵母粉購自英國OXOID公司；氨芐青霉素購自Ameresco公司；IPTG購自Merck公司；丙烯酰胺（Acr）及甲叉雙丙烯酰胺（Bis）購自Promega公司；四甲基乙二胺（TEMED）購自 BioRad 公司；考馬斯亮藍(lán)R-250購自Sanland公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；Goat-Rabbit IgG-HRP購自 Bioworld；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3試驗動物本研究所用動物為健康的新西蘭大白兔。

1.2試驗方法

1.2.1pGEX-4T-1-hAPOA1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)人源的hAPOA1基因序列（Gene ID：335）設(shè)計引物，5′和3′端分別加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點。上游引物：5′-CCGGAATTCATGAAAGCTGCGGTGCTGACCTT -3′；下游引物：5′-AAAGCGGCCGCTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT-3′。以hAPOA1的全長cDNA序列為模板進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1載體分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，并用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切篩選陽性克隆，并進(jìn)行DNA測序，該重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-hAPOA1（具體操作參考Novagen公司pET System Manual）。

1.2.2谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）-hAPOA1融合蛋白的小試誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hAPOA1轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21（DE3），在平板上挑取3個克隆，各接種于4 mL含氨芐青霉素100 mg/L的LB液體培養(yǎng)基（含胰蛋白胨0.04 g，酵母提取物0.02 g，NaCl 0.04 g），37 ℃ 振蕩培養(yǎng)4 h，使D600 nm達(dá)到0.8～1.0，加異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，12 500 g 離心10 min后收集菌體并留樣進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE），結(jié)合考馬斯亮藍(lán)G-250染色，脫色后分析融合蛋白表達(dá)與否。

1.2.3GST-hAPOA1融合蛋白的大量表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物分布將上述鑒定正確表達(dá)的pGEX-4T-1-hAPOA1-BL21（DE3）凍存菌株接種于4 mL含氨芐青霉素100 mg/L的LB液體培養(yǎng)基（含胰蛋白胨0.04 g，酵母提取物0.02 g，NaCl 0.04 g）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，然后取4 mL接種到400 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)2～4 h，D600 nm達(dá)到0.8～10時，加IPTG至終濃度0.5 mmol/L，20 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 12 h，12 500 g 離心10 min收集菌體并留樣，按1 g菌體沉淀加 5 mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎（設(shè)置為工作5 s，間歇6 s，功率300 W，全程時間20 min）后，12 500 g、4 ℃離心15 min后取上清和沉淀留樣，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)合考馬斯亮藍(lán)G-250染色，脫色后分析GST-hAPOA1融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)量及存在形式。

1.2.4GST-hAPOA1融合蛋白的純化對于上述大量誘導(dǎo)的包涵體蛋白，分別用2、3、4、6、8 mol/L尿素溶液對沉淀進(jìn)行梯度重懸、洗滌處理，每次洗滌完后于4 ℃、12 500 g離心 20 min 重新收集沉淀，接著將洗脫下的目的蛋白裝入透析袋，放入PBS中透析過夜。SDS-PAGE結(jié)合Western-Blot檢驗洗脫后的蛋白；采用二喹啉甲酸（BCA）法微量蛋白濃度測量試劑盒測定純化后蛋白濃度，分裝后于-80 ℃保存。

1.2.5hAPOA1多克隆抗體的制備將純化并透析過的包涵體融合蛋白按常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔（注射總量為500 μg/只），首次免疫加等體積弗氏完全佐劑乳化后，大腿肌肉多位點注射；3周后以同樣的抗原劑量與弗氏不完全佐劑乳化后增強免疫；此后每隔7 d以同樣的抗原劑量加強免疫1次，共3次。第2次、第3次加強免疫前均耳緣靜脈采血，分離血清，以hAPOA1純化融合蛋白（2 μg/mL）為抗原進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附測定（ID-ELISA）測定[3]，以免疫前家兔血清作為陰性對照，PBS作為空白對照，效價檢測合格后在第3次加強免疫后7 d進(jìn)行頸動脈采全血作為陽性血，同樣用 ID-ELISA方法測定免疫兔血清抗體效價。血液處理方法：37 ℃靜置1 h，4 ℃靜置過夜，5 000 r/min離心15 min，吸取上清于50 mL離心管，再次 5 000 r/min 離心 15 min，吸取上清，留取近期使用量于2～8 ℃存放，其余分裝后置于-80 ℃。

1.2.6hAPOA1血清抗體特異性檢測取純化后的融合蛋白GST-hAPOA1及空載體pGEX-4T-1表達(dá)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE后，采用電轉(zhuǎn)膜法（100 V，60 min）轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜上，5%脫脂奶粉封閉后，以本試驗制備的兔抗血清（1 ∶[KG-*3]500稀釋）為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔[JP2]IgG（1 ∶[KG-*3]12 000稀釋）為二抗進(jìn)行反應(yīng)。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）避光顯色15 min左右，條帶清晰后用雙蒸水洗以終止反應(yīng)。

2結(jié)果與分析

2.1pGEX-4T-1-hAPOA1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用上述設(shè)計的引物對hAPOA1進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1-a）顯示，擴增出1個特異性的DNA條帶，分子量大小介于750 bp與1 000 bp之間，與理論值804 bp相符。對重組質(zhì)粒用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，獲得大小約為5 000、800 bp的2個條帶（圖1-b），與理論值4 969、804 bp一致，初步說明重組成功。重組質(zhì)粒經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果正確，可以確定 pGEX-4T-1-hAPOA1 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2GST-hAPOA1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

hAPOA1基因編碼267個氨基酸，由于克隆的hAPOA1基因插入位置在pGEX-4T-1載體的GST-tag下游，使用hAPOA1基因自帶的終止密碼子，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽蛋白分子量約為26 ku，所以重組菌表達(dá)的hAPOA1分子量約為55.4 ku。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-hAPOA1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21，隨機挑取3個克隆，37 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)小試，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在 55 ku 位置有較濃的特征蛋白條帶出現(xiàn)，與預(yù)期分子量一致，而對照組均無此條帶，說明重組菌能表達(dá)出hAPOA1蛋白（圖未顯示）。將上述鑒定正確的pGEX-4T-1-hAPOA1-BL21凍存菌于20 ℃放大誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，上清中幾乎無融合蛋白GST-hAPOA1表達(dá)（圖2），證明融合蛋白GST-hAPOA1以包涵體形式在宿主菌內(nèi)高效表達(dá)。

2.3GST-hAPOA1融合蛋白的純化

對包涵體純化后，收集的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析、Western Blot檢測并經(jīng)BCA法計算可得，其濃度為1.10 mg/mL，純度約為90%，6 mol/L尿素溶液洗脫后獲得的融合蛋白的純度及產(chǎn)量最佳（圖3）。

2.4hAPOA1抗血清效價測定

將純化后并經(jīng)過透析的融合蛋白作為免疫原，采用肌肉多[CM（25]點注射免疫新西蘭大白兔，4次注射后進(jìn)行抗血清的效價[CM）]

為抗原進(jìn)行ID-ELISA測定，以表達(dá)的hAPOA1融合蛋白作抗原，抗血清稀釋 40 000 倍以上仍明顯地呈陽性反應(yīng)（圖4）。效價判斷標(biāo)準(zhǔn)為大于最大D450 nm的50%的最小D450 nm所對應(yīng)的稀釋度，本抗血清效價為 1 ∶[KG-*3]40 000。

2.5抗體免疫原性鑒定

[JP2]對純化的融合蛋白GST-hAPOA1及空載體pGEX-4T-1表達(dá)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將凝膠上的目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜中，并對NC膜進(jìn)行封閉、一抗、二抗孵育，然后用DAB顯色，結(jié)果在55 ku處出現(xiàn)明顯的特異性雜交條帶（圖5），表明本試驗制備的多克隆抗體具有免疫反應(yīng)性和蛋白特異性，同時也表明融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)獲得了成功。

[FK（W15][TPXZW5.tif；S+3mm]

3討論

高密度脂蛋白（HDL）具有促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運及抗動脈硬化作用，Apoa1是HDL的結(jié)構(gòu)蛋白，幾乎有所HDL都含有Apoa1，其水平可直接反映HDL在體內(nèi)情況，Apoa1在HDL功能如抗氧化、抗炎方面至關(guān)重要，與冠心病呈負(fù)相關(guān)性[4]。另外，有研究表明，聯(lián)合檢測載脂蛋白A與載脂蛋白B（ApoB）對血脂的判斷具有重要的臨床價值[5-6]，測定載脂蛋白及脂蛋白HDL、低密度脂蛋白（LDL）對分析病理發(fā)生狀態(tài)很有幫助。由此可見Apoa1對于醫(yī)學(xué)診斷及疾病治療的重要性。目前生產(chǎn)大量Apoa1抗血清，主要采用高密度脂蛋白純化的Apoa1作為抗原免疫得來。由于大量血清中分離純化Apoa1的過程中不可避免會有一些血清蛋白等雜蛋白的污染，去掉這些影響抗體交叉反應(yīng)的雜蛋白成分，勢必會提高抗體生產(chǎn)成本。如果用含雜蛋白污染的Apoa1作為抗原免疫動物后，必然會導(dǎo)致非特異性抗體的產(chǎn)生，而Apoa1的臨床精確檢測需要高質(zhì)量的抗體。本研究詳細(xì)報道了抗Apoa1抗體的制備過程，利用自主表達(dá)的Apoa1的重組蛋白抗原，不存在大量血清蛋白殘留的問題，且生產(chǎn)成本低，抗體特異性及效價均很好，是一種非常經(jīng)濟(jì)可取的抗體制備方法。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

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