??+張廷婷+馬登超+宮清軒+李春娟+閆彩霞+趙小波+單世華

摘要：本研究對(duì)利用基因芯片技術(shù)從抗、感黃曲霉花生品種中分離出的差異表達(dá)基因PnLOX2進(jìn)行原核表達(dá)，得到分子量為121.5 kD的融合表達(dá)產(chǎn)物；構(gòu)建了PnLOX2基因的3′端反向重復(fù)結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)化花生，得到了轉(zhuǎn)基因花生苗，為反向鑒定PnLOX2基因在花生抗黃曲霉侵染過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；抗黃曲霉；原核表達(dá)；反向重復(fù)結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.203.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）09-0001-06

花生是我國(guó)主要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)家油脂安全和農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易中占有舉足輕重的地位。我國(guó)是世界生產(chǎn)花生最多的國(guó)家?；ㄉ资茳S曲霉感染，黃曲霉污染不僅直接危害人們的健康而且影響花生的品質(zhì)和外貿(mào)出口，因此人們一直設(shè)法采取各種措施防止[1]。應(yīng)用抗病品種是病害防治最直接有效的方法，但花生抗黃曲霉種質(zhì)資源匱乏，加之常規(guī)育種周期長(zhǎng)使得抗病品種遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用基因工程手段將外源抗病基因?qū)牖ㄉ鸀槠淇共∮N帶來(lái)了新的希望[2]。

目前國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于花生抗黃曲霉基因克隆和鑒定的研究。Moyne等[3]從Bacillus subtilis AU195菌中分離出芽孢霉素，體外試驗(yàn)證明其對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，目前該基因的分離克隆已經(jīng)完成。還有研究認(rèn)為，大豆脂肪酸氧化酶基因（LOX）對(duì)黃曲霉菌的侵染和產(chǎn)毒具有抗性作用[4]，但該觀(guān)點(diǎn)尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。核糖體失活蛋白（RIP）對(duì)抑制黃曲霉菌侵染和產(chǎn)毒也具有重要作用[5]。單世華等[6]分離克隆到花生種皮NBS結(jié)構(gòu)域4個(gè)抗黃曲霉相關(guān)基因，如PnLOX2等，初步試驗(yàn)表明，這些基因在抗黃曲霉侵染過(guò)程中起到重要的抵御作用。

研究證明，發(fā)生于不同物種上的RNA沉默的直接引發(fā)因子都是雙鏈RNA（dsRNA）[7～9]。dsRNA形成的一條有效途徑就是將體外構(gòu)建的反向重復(fù)（inverted repeats， IR）結(jié)構(gòu)引入轉(zhuǎn)基因植株。反向重復(fù)結(jié)構(gòu)由兩段IR DNA序列和一段spacer序列組成，兩段IR DNA由spacer連接起來(lái)，轉(zhuǎn)錄后會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hpRNA）。hpRNA由“莖”（stem，是IR DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物配對(duì)形成的雙鏈）和“環(huán)”（loop，是spacer DNA轉(zhuǎn)錄的單鏈結(jié)構(gòu)）組成。其中，雙鏈“莖”部分是誘發(fā)基因沉默的關(guān)鍵部位，“莖”的長(zhǎng)短影響RNA沉默的效率和穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)植物中適當(dāng)長(zhǎng)度的dsRNA同源片段均能高效誘發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）[10]。李鵬等在前期研究中轉(zhuǎn)化PVYN-CP基因5′端和3′端不同“莖”長(zhǎng)度（環(huán)50 bp）hpDNA的煙草均獲得了很高的抗病率[11～13]，并證明3′端序列的hpRNA沉默效率要高于5′端。

本研究構(gòu)建了PnLOX2基因的原核表達(dá)載體，將該基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，為下一步純化蛋白并進(jìn)行體外抑菌鑒定提供基礎(chǔ)。同時(shí)以PnLOX2基因的cDNA為模板構(gòu)建3′端（莖207 bp，環(huán)40 bp）的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)化花生，以檢測(cè)PnLOX2的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)對(duì)于轉(zhuǎn)錄后基因沉默的誘導(dǎo)效應(yīng)，為反向鑒定PnLOX2基因在花生抗黃曲霉侵染過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料花生品種J11（高抗黃曲霉）、金花1012（高感黃曲霉）、花育22（中感黃曲霉）由山東省花生研究所提供。

1.1.2菌株和質(zhì)粒載體載體pGEX-4T-1、pUC19、pROK Ⅱ和大腸桿菌BL21、農(nóng)桿菌EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3儀器與試劑試驗(yàn)用高速冷凍離心機(jī)由美國(guó)BECKMAN公司生產(chǎn)；紫外凝膠成像儀、瓊脂糖凝膠電泳儀及配套電泳槽等由博日公司生產(chǎn)；垂直電泳裝置及電泳儀為北京六一儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；其它如電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、渦旋混合儀、1/10000和1/10電子天平、754-UV紫外分光光度計(jì)、pH計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、全溫?fù)u床等均為國(guó)產(chǎn)。

Tris、SDS（電泳級(jí)）、EDTA、DTT、TEMED購(gòu)自Solarbio公司；溶菌酶、丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺購(gòu)自上海生工生物技術(shù)工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Taq酶、內(nèi)切酶、連接酶購(gòu)自大連寶生物公司；其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA提取方法參照天根公司質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)。PnLOX2基因產(chǎn)物與pGEX-4T-1載體用Sma Ⅰ和XhoⅠ分別雙酶切，37℃酶切3 h，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分別回收目的片段，T4 DNA Ligase、16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。利用菌落PCR（引物P1：5′-ATGTTTTCAGGGGTAACCGG-3′，P2：5′-TTAGATAGAGATGCTGTTTG-3′）、酶切和測(cè)序方法對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行鑒定。

參照王關(guān)林《植物基因工程》[14]制備大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-PnLOX2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化宿主菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，以轉(zhuǎn)化空載體pGEX-4T-1為對(duì)照。鑒定轉(zhuǎn)化的正確性。

1.2.2目的基因誘導(dǎo)表達(dá)挑取鑒定為陽(yáng)性的克隆菌和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照菌分別接種于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)物接種于新的含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，在2、3、4 h分別取樣檢測(cè)OD550值，至OD550=0.5～1.0時(shí)加IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，30℃誘導(dǎo)表達(dá)2～3 h，取菌液，提取蛋白粗提物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、染色及脫色，方法參照王關(guān)林《植物基因工程》[14]。

1.2.3PnLOX2 3′端反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建（1） PnLOX2 3′端反向重復(fù)（inverted repeat， IR） 結(jié)構(gòu)引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已克隆的 PnLOX2 3′全長(zhǎng)的cDNA序列（2 592 bp）設(shè)計(jì)合成引物（表1，下劃線(xiàn)部分即酶切位點(diǎn)）。片段Ⅰ和片段Ⅱ連接后形成反向重復(fù)結(jié)構(gòu)（IR），轉(zhuǎn)錄后形成hpRNA （圖1）。

（2）PnLOX2 3′端反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建：以 PnLOX2 3′cDNA為模板，利用人工合成的2對(duì)PCR引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的片段Ⅰ、Ⅱ，經(jīng)純化后分別用BamH Ⅰ酶切，回收酶切產(chǎn)物，將摩爾數(shù)大致相等的2個(gè)片段用T4 DNA Ligase、16℃反應(yīng)過(guò)夜，片段Ⅰ和片段Ⅱ的連接產(chǎn)物用3′IR表示。對(duì)3′IR和pUC19質(zhì)粒用XbaⅠ和KpnⅠ分別進(jìn)行雙酶切，連接得到重組載體pUC19-3′IR，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

1.2.4植物表達(dá)載體構(gòu)建用Xba Ⅰ 和Kpn Ⅰ 雙酶切重組克隆質(zhì)粒pUC19-3′IR，回收3′IR，插入到雙元表達(dá)載體pROK Ⅱ 的CaMV 35S啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶基因（nos）終止子之間的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切位點(diǎn)，獲得植物表達(dá)載體pROK-3′IR。

1.2.5花生轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)利用凍融法將植物表達(dá)載體pROK-3′IR直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，同時(shí)以轉(zhuǎn)化pROK Ⅱ空質(zhì)粒為對(duì)照。用侵染胚小葉法分別轉(zhuǎn)化花育22、J11和金花1012，再生植株通過(guò)卡那霉素抗性篩選、PCR檢測(cè)（引物P3：5′-TTCATTTGGAGAGAACACGG-3′，來(lái)自CaMV 35S啟動(dòng)子序列；P4：5′-GCGCGGATCCGAATCACACTTAGCTGTCT-3′。擴(kuò)增片段約為350 bp）以及Southern-blot檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

2結(jié)果與分析

2.1PnLOX2基因原核表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)PnLOX2基因及pGEX-4T-1表達(dá)載體分別進(jìn)行SmaⅠ和XhoⅠ雙酶切，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3，分別獲得2 500 bp的目的基因片段和4 900 bp的載體片段，酶切結(jié)果較好，可進(jìn)行下一步連接試驗(yàn)。

將PnLOX2基因片段與pGEX-4T-1載體片段按摩爾比1∶3～1∶8混合，T4 DNA Ligase連接過(guò)夜，獲得原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PnLOX2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

2.2pGEX-4T-1-PnLOX2重組載體鑒定

2.2.1菌落PCR鑒定挑取經(jīng)藍(lán)白斑篩選的白色菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖4可以看出，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α獲得了5個(gè)陽(yáng)性克隆。由圖5可知，

2.2.2酶切鑒定pGEX-4T-1-PnLOX2單、雙酶切鑒定結(jié)果如圖6（1～3：DH5α，4～6：BL21）所示，雙酶切均獲得了2 500 bp的PnLOX2基因片段和4 900 bp的pGEX-4T-1載體片段。條帶3、6為單酶切結(jié)果。單、雙酶切結(jié)果表明目的基因片段已與載體連接并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和BL21。

2.2.3測(cè)序鑒定經(jīng)測(cè)序分析，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α及BL21的PnLOX2基因與原序列的同源性分別為99%和98%，各編碼863個(gè)氨基酸，無(wú)突變和移碼，可以進(jìn)行下一步的原核表達(dá)試驗(yàn)。

2.3PnLOX2基因的原核表達(dá)

如圖7可以看出，與轉(zhuǎn)化空載體對(duì)照相比，重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-PnLOX2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，在121.5 kD處有明顯條帶。表明PnLOX2基因能在大腸桿菌中表達(dá)，這為下一步確定目的蛋白在體細(xì)胞中的分布及蛋白抑菌鑒定奠定了基礎(chǔ)。

2.4PnLOX2 3′端反向重復(fù)結(jié)構(gòu)及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以PnLOX2的cDNA為模板，利用人工合成的2對(duì)PCR引物（表1）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切（BamHⅠ）、連接處理后獲得3′IR，3′IR再同時(shí)與pUC19質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（XbaⅠ和KpnⅠ）后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定、PCR檢測(cè)表明，3′IR已插入到pUC19中（圖8）。

分別用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切重組克隆載體pUC19-3′IR，切下目的基因3′IR，插入到植物雙元表達(dá)載體pROKⅡ的位點(diǎn)XbaⅠ和KpnⅠ之間。酶切鑒定表明成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pROK-3′IR。

2.5轉(zhuǎn)基因植株的獲得與篩選

將植物表達(dá)載體pROK-3′IR及空質(zhì)粒pROKⅡ利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。利用侵染幼胚小葉的方法將pROK-3′IR轉(zhuǎn)化花生品種花育22、J11和金花1012，分別獲得再生植株，如圖9所示，轉(zhuǎn)基因植株在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正常。

2.6轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

以微量提取的轉(zhuǎn)基因植株總DNA和非轉(zhuǎn)基因植株花育22總DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖10）顯示，非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)擴(kuò)增條帶，而轉(zhuǎn)化植株（除編號(hào)為7外）均擴(kuò)增出一條大小約為350 bp的條帶，與預(yù)期大小相同，初步證明目的基因已經(jīng)整合到花生的基因組中。

2.7轉(zhuǎn)基因植株的Southern-blot檢測(cè)

為了進(jìn)一步證明目的基因已經(jīng)整合到花生基因組中，大量提取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因花育22植株的總DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切，以目的基因PnLOX2的DNA片段為探針，進(jìn)行Southern雜交分析。結(jié)果（圖11）顯示，陽(yáng)性對(duì)照有1條雜交帶，轉(zhuǎn)基因植株有1～3條雜交帶，非轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有雜交帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入花生，并整合到花生基因組中，并且不同轉(zhuǎn)基因植株中存在不同的拷貝數(shù)。

3結(jié)論與討論

本研究構(gòu)建了PnLOX2基因的原核表達(dá)載體，與GST融合后重組蛋白大小為121.5 kD，蛋白較大，較難于表達(dá)。通過(guò)分析PnLOX2基因重組蛋白表達(dá)量，推測(cè)PnLOX2基因所表達(dá)的蛋白應(yīng)為一種抑菌蛋白。本試驗(yàn)為下一步純化蛋白進(jìn)行體外抑菌鑒定、利用基因工程手段解決花生黃曲霉污染提供基礎(chǔ)。

dsRNA是誘發(fā)基因沉默的關(guān)鍵因子，人為設(shè)計(jì)的反向重復(fù)序列在轉(zhuǎn)基因植物中形成dsRNA可以誘發(fā)高效的基因沉默[10]。研究表明，hpRNA中的“莖”部分是誘發(fā)基因沉默的關(guān)鍵部位，影響RNA沉默的效率和所形成的hpRNA的穩(wěn)定性。目前的RNA沉默研究中，多以目的基因的5′端和3′端構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化植物[11，12，15～23]，并以3′端效率更高[17～22]。因此，本研究構(gòu)建PnLOX2基因的3′端反向重復(fù)結(jié)構(gòu)用以轉(zhuǎn)化不同類(lèi)型的花生植株，并獲得轉(zhuǎn)基因后代，下一步將檢測(cè)pROK-3′IR是否誘發(fā)PnLOX2基因沉默以及轉(zhuǎn)基因植株的抗黃曲霉效果。

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