薛濤濤++邊金++伍陸++趙秀娟++崔向軍++蔡祿

摘要：組蛋白修飾，例如甲基化、乙酰化等修飾對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要。為揭示組蛋白H3第56位賴(lài)氨酸（K）修飾對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的重要性，構(gòu)建H3K56定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔ˋ）的組蛋白突變株H3K56A，并對(duì)其在高溫、高鹽等條件下的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行初步檢測(cè)。根據(jù)酵母同源重組的原理，采用兩步替換法構(gòu)建H3K56A突變菌株，用分光光度法測(cè)定突變菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并分別在高鹽、高溫條件下檢測(cè)突變體的表型。結(jié)果表明，釀酒酵母組蛋白H3K56A突變菌株構(gòu)建成功，其生長(zhǎng)曲線(xiàn)與野生型無(wú)明顯差異；H3K56A突變株對(duì)高溫、高鹽條件均較敏感，且在高鹽條件下，菌體生長(zhǎng)緩慢、菌落偏小，表明組蛋白H3K56位點(diǎn)的修飾可能與釀酒酵母抗高鹽、高溫機(jī)制有關(guān)。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母；H3K56A突變菌；組蛋白修飾；兩步替換法；同源重組；高鹽環(huán)境；高溫環(huán)境；抗逆機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0077-05

收稿日期：2015-11-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：61361014、31260274）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（編號(hào)：2015MS0334）。

作者簡(jiǎn)介：薛濤濤（1990—），女，山西臨縣人，碩士研究生，主要從事表觀(guān)遺傳學(xué)研究。E-mail：xuetaotao196485@163.com。

通信作者：趙秀娟，博士，教授，主要從事表觀(guān)遺傳學(xué)研究。E-mail：zhaoxiujuan@imust.cn。

核小體是真核生物細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)的基本組成單位，它由147 bp的DNA纏繞核心組蛋白八聚體形成[1]，組蛋白H1與2個(gè)核小體之間有40～60 bp的連接DNA以穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)[2]。組蛋白八聚體具有球狀的三維結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)氨基端則游離在三維球形的表面，游離氨基端的氨基酸殘基可以被共價(jià)修飾[3]。在釀酒酵母中，編碼核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4的基因都有2個(gè)拷貝，主要的核心組蛋白基因組成4個(gè)基因座，每個(gè)基因座包含2個(gè)組蛋白基因，這2個(gè)基因共用1個(gè)中心啟動(dòng)子并以不同的方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。編碼組蛋白H3、H4的2個(gè)基因分別為HHTI-HHF1、HHT2-HHF2，分別位于Ⅱ號(hào)、XIV號(hào)染色體上[4]，在基因組中這2個(gè)拷貝只要有1個(gè)存在，便可維持細(xì)胞的正常生存[5]。組蛋白H2A、H2B的2個(gè)基因座分別為HTA1-HTBI、HTA2-HTB2，它們編碼幾乎相同的組蛋白H2A、H2B[6]。與組蛋白H3/H4不同的是基因座HTA1-HTBI對(duì)于細(xì)胞的生存是必需的，但HTA2-HTB2卻不是。組蛋白上能發(fā)生共價(jià)修飾的氨基酸殘基稱(chēng)為修飾位點(diǎn)，組蛋白修飾主要發(fā)生在組蛋白的N-末端殘基上[7]。常見(jiàn)的修飾種類(lèi)包括組蛋白乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化，以及研究較少的小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，簡(jiǎn)稱(chēng)SUMO）化、生物素化等[8]。其中賴(lài)氨酸、精氨酸的甲基化，絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化，賴(lài)氨酸的乙?；?、泛素化、SUMO化在酵母核心組蛋白中都被檢測(cè)出來(lái)，而且這些修飾大多數(shù)都是可逆的[9]。近年來(lái)研究表明，組蛋白修飾在調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)等生命活動(dòng)中起重要的調(diào)控作用。

通過(guò)組蛋白翻譯后修飾的染色質(zhì)的表觀(guān)遺傳學(xué)變異對(duì)于環(huán)境因素誘導(dǎo)引起的基因轉(zhuǎn)錄的變化是很重要的。然而，在外界環(huán)境刺激下組蛋白修飾是如何被調(diào)控的目前還知之甚少，但是這種表觀(guān)遺傳調(diào)控途徑對(duì)細(xì)胞適應(yīng)與抵御外界不良環(huán)境卻極為重要[10]。細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境變化都會(huì)引起核染色質(zhì)的變化，從而調(diào)控基因的表達(dá)，但是目前對(duì)這種調(diào)控機(jī)制的研究并不是很深[11]。外界環(huán)境變化信號(hào)如養(yǎng)分的缺失、鹽離子脅迫和溫度的變化等都會(huì)影響基因的表達(dá)及細(xì)胞的發(fā)育[12]。為研究組蛋白乙?；揎棇?duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并探討組蛋白修飾在釀酒酵母應(yīng)對(duì)外界環(huán)境壓力時(shí)所起的作用，本研究以釀酒酵母為材料，構(gòu)建H3K56突變?yōu)楸彼幔ˋ）的組蛋白突變菌株，對(duì)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行測(cè)定，并在高鹽、高溫條件下與其他位點(diǎn)修飾突變菌株的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行比較。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741：MATa ura3Δ0 hisΔ0 leu2Δ0 met15Δ0；質(zhì)粒pAG25由內(nèi)蒙古科技大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。組蛋白H3基因突變質(zhì)粒pBB6-Hhf2-hht2K56A由戴俊彪實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2試劑、酶與引物卡那霉素、鮭魚(yú)精DNA，購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司；諾爾斯菌素，購(gòu)自北京啟維益成科技有限公司；乙酸鋰，購(gòu)自美國(guó)MYM生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶，購(gòu)自TaKaRa；BciⅥ酶，購(gòu)自NEB BioLabs；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2引物設(shè)計(jì)

本研究所設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1，其中引物Nat-F、Nat-R的小寫(xiě)部分分別為HHT1-HHF1基因的左右同源臂序列，引物A、B、C、D、Kan B、Kan C為第1步替換鑒定所用引物，引物P1、N1、P2為第2步替換鑒定所用引物。引物位置見(jiàn)圖1。

1.3釀酒酵母Ⅱ號(hào)染色體HHT1-HHF1基因敲除

1.3.1NAT基因的擴(kuò)增參照Dai等的方法[13]，以質(zhì)粒pAG25為模板擴(kuò)增NAT基因，同時(shí)在其上下游引物5′端分別加上Ⅱ號(hào)染色體組蛋白H3/H4基因左右同源序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到左右兩側(cè)含有組蛋白H3/H4基因左右同源序列的NAT基因。PCR反應(yīng)體系：5 μL 10×Ex Buffer（Mg2-），3 μL MgCl2，4 μL dNTPs，1.5 μL正向引物（10 μmol/L），1.5 μL 反向引物（10 μmol/L），1.5 μL模板（pAG25，100 ng/L），0.3 μL Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）；加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.3.2酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[14]，接種酵母菌BY4741單菌落至YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接過(guò)夜培養(yǎng)的菌液至新的YPD液體培養(yǎng)基中，至D600 nm為0.1，于30 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.6～1.0；收集細(xì)胞，用0.1 mol/L LiAc/TE 清洗細(xì)胞，重懸細(xì)胞于100 μL 0.1 mol/L的LiAc/TE中；取2 μL上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化緩沖液體系：312 μL 50% PEG3350、41.4 μL 1 mol/L LiAc、47.9 μL二甲基亞砜（DMSO）、25 μL 10 mg/mL 鮭魚(yú)精DNA（用前用沸水煮 5 min），30 ℃孵育30 min，42 ℃熱激15 min；收集細(xì)胞，用5 mmol/L CaCl2清洗細(xì)胞，加1 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃孵育6 h；用ddH2O清洗細(xì)胞，在無(wú)菌操作臺(tái)中用含有 100 μg/mL 諾爾斯菌素在YPD固體培養(yǎng)基上涂板。

1.3.3陽(yáng)性菌落的鑒定挑取平板上的單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)，提取基因組，用鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取成功替換的陽(yáng)性克隆。PCR鑒定反應(yīng)體系：2 μL 10×Buffer（Mg2+），1.5 μL dNTPs，0.1 μL正向引物（10 μmol/L），0.1 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL模板（基因組）（700 ng/μL），0.1 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）；加ddH2O至15 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4釀酒酵母XIV號(hào)染色體HHT2-HHF2基因定點(diǎn)突變

1.4.1pBB6-Hhf2-hht2K56A突變質(zhì)粒的提取與酶切過(guò)夜培養(yǎng)含pBB6-Hhf2-hht2K56A突變質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α，用試劑盒法提取質(zhì)粒，用BciⅥ進(jìn)行酶切，酶切體系：8 μL 質(zhì)粒DNA（350 ng/μL），5 μL NEB Buffer4（10×），0.5 μL BciⅥ（10 000 U/mL）；加ddH2O至50 μL，37 ℃酶切 2 h。

1.4.2酵母轉(zhuǎn)化接種“1.3.3”節(jié)所鑒定的Ⅱ號(hào)染色體HHT1-HHF1基因敲除的酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)，取10 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化緩沖液體系及步驟同“1.3.2”節(jié)。轉(zhuǎn)化后在尿嘧啶缺陷型酵母培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)SC-Ura）固體培養(yǎng)基上涂板。

1.4.3H3K56A突變菌株的鑒定挑取單菌落于YPD液體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)，提取基因組，用鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取成功替換的陽(yáng)性克隆。PCR鑒定反應(yīng)體系參照“1.3.3”節(jié)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.5生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

對(duì)野生菌株BY4741、Ⅱ號(hào)染色體HHT1-HHF1基因敲除菌株、XIV號(hào)染色體組蛋白H3K56A定點(diǎn)突變菌株分別進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定。分別取3個(gè)裝有250 mL YPD液體培養(yǎng)基的三角甁，加入體積分?jǐn)?shù)1%的已活化18 h的酵母培養(yǎng)液，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。在培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h時(shí)取培養(yǎng)液，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基作參比，使用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度D600 nm。

1.6H3K56A突變菌株表型及抗高鹽、高溫能力檢測(cè)

為了研究H3K56位點(diǎn)進(jìn)行的修飾對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的重要性，分別接種組蛋白H3K14A、H3K14R、H3K56A、H3K79A突變菌株與野生菌株BY4741、Ⅱ號(hào)染色體HHT1-HHF1基因敲除菌株于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)整過(guò)夜培養(yǎng)各樣品至同一濃度，每個(gè)菌株做5個(gè)濃度梯度稀釋?zhuān)總€(gè)濃度取5 μL進(jìn)行接種，使其總接種細(xì)胞數(shù)分別為10 000、2 000、400、80、16個(gè)。試驗(yàn)組接種培養(yǎng)基為普通YPD固體培養(yǎng)基與含1 mol/L NaCl的YPD固體培養(yǎng)基，接種后分別在39、30 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)照組接種培養(yǎng)基為普通YPD固體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)。觀(guān)察菌株生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)至3 d時(shí)拍照。

2結(jié)果與分析

2.1HHT1-HHF1基因敲除菌株的構(gòu)建及鑒定

質(zhì)粒pAG25大小為3 704 bp，圖2為質(zhì)粒在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中得到的電泳結(jié)果。以質(zhì)粒pAG25為模板擴(kuò)增所得NAT基因大小約為1 300 bp，NAT基因1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖3）顯示，目的條帶與實(shí)際大小相符。上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)乙酸鋰轉(zhuǎn)化，在含有諾爾斯菌素的YPD固體培養(yǎng)基上成功獲得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子，提取其基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。由圖4可見(jiàn)，點(diǎn)樣孔1、3沒(méi)有擴(kuò)增出產(chǎn)物，而點(diǎn)樣孔2、4擴(kuò)增出約800 bp的片段，表明該菌落Ⅱ號(hào)染色體HHT1-HHF1成功被NAT基因替換，已成功鑒定出陽(yáng)性菌株。

2.2H3K56A突變菌株的構(gòu)建及鑒定

組蛋白H3修飾突變質(zhì)粒pBB6-Hhf2-hht2K56A上有BciⅥ酶的4個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切片段大小分別為4 071、2 575、1 527、613 bp，其中4 071 bp大小的片段上含有組蛋白H3突變基因HHTs-HHFS、URA3基因、組蛋白H3/H4基因HHT2-HHF2左右同源序列。質(zhì)粒經(jīng)酶BciⅥ酶切結(jié)果見(jiàn)圖5，酶切產(chǎn)物經(jīng)乙酸鋰轉(zhuǎn)化后，在SC-Ura平板上得到轉(zhuǎn)化子。以轉(zhuǎn)化子基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。由圖6可見(jiàn)，樣孔1以P1+P2為引物PCR擴(kuò)增出1段約700 bp的片段，而樣孔2以P1+N1為引物則沒(méi)有擴(kuò)增出片段，表明其XIV號(hào)染色體HHT2-HHF2基因已被H3K56A突變基因替換。

2.3生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

由圖7可知，釀酒酵母的生長(zhǎng)在前4 h處于調(diào)整期，4～10 h酵母生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期，10 h以后處于穩(wěn)定期。對(duì)野生菌株BY4741、Ⅱ號(hào)染色體NAT突變菌株、XIV號(hào)染色體組蛋白H3K56A突變菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行比較可知，其生長(zhǎng)期無(wú)明顯差異，說(shuō)明組蛋白H3K56A突變對(duì)于酵母菌的生長(zhǎng)期無(wú)明顯影響。

2.4菌株表型及抗高鹽、高溫能力檢測(cè)

組蛋白K3K56A突變后該位點(diǎn)將不能被乙?；揎?，而組蛋白H3K56位點(diǎn)的乙酰化修飾對(duì)于DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程卻是必不可少的。筆者將H3K56A突變菌株與其他位點(diǎn)突變菌株H3K14A、H3K14R、H3K79A和單拷貝組蛋白H3/H4基因Ⅱ號(hào)染色體NAT突變菌株、野生BY4741菌株分別在高溫、高鹽脅迫下的表型進(jìn)行比較。由圖8-A可以看出，在正常培養(yǎng)條件下，失去Ⅱ號(hào)染色體1個(gè)H3/H4基因拷貝后的hht1Δhhf1Δ菌株生長(zhǎng)情況與野生型并無(wú)多大區(qū)別，說(shuō)明對(duì)于組蛋白H3/H4來(lái)說(shuō)，只須保證它在基因組中有1個(gè)拷貝便可滿(mǎn)足其正常生長(zhǎng)。其他4種組蛋白突變株H3K14A、H3K14R、H3K56A、H3K79A的生長(zhǎng)情況正常，說(shuō)明這4個(gè)組蛋白修飾位點(diǎn)的突變并沒(méi)有對(duì)酵母的正常生存造成影響。由圖8-B、圖8-C可見(jiàn)，在高鹽、高溫脅迫下，H3K56A突變體生長(zhǎng)情況不如其他菌株，說(shuō)明在對(duì)抗高鹽、高溫不利環(huán)境條件方面，H3K56位點(diǎn)的修飾可能更為重要。同時(shí)對(duì)比圖8中A、B、C3種條件下菌落生長(zhǎng)情況還可以看出，在高鹽脅迫下所有菌株的菌落生長(zhǎng)緩慢，表明高鹽可能會(huì)抑制酵母細(xì)胞菌落的生長(zhǎng)。

3討論

組蛋白特定位點(diǎn)的乙?；?、甲基化等修飾與DNA的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。組蛋白的乙?；谌旧|(zhì)轉(zhuǎn)錄活性的激活過(guò)程中起重要作用[15]，目前人們對(duì)組蛋白K3K56位點(diǎn)的乙?；揎椦芯枯^為深入。組蛋白H3K56ac在啟動(dòng)子區(qū)域通過(guò)破壞核小體上DNA進(jìn)出口處組蛋白H3與DNA的相互作用，從而促進(jìn)核小體的分解，進(jìn)而促使轉(zhuǎn)錄的起始[16]。在釀酒酵母中，組蛋白H3K56的乙?；峭ㄟ^(guò)組蛋白分子伴侶Asf1、乙酰轉(zhuǎn)移酶Rtt109來(lái)調(diào)節(jié)的，在表觀(guān)遺傳水平上通過(guò)與其他因子的相互作用來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)[17]。本研究采用2步替換法來(lái)構(gòu)建H3K56A突變株，首先采用PCR的方法擴(kuò)增NAT基因，由于其引物5′端添加了40 bp 的H3/H4基因左右同源序列，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)乙酸鋰轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，在基因組復(fù)制過(guò)程中可以與Ⅱ號(hào)染色體上基因H3/H4發(fā)生同源重組，從而成功敲除了Ⅱ號(hào)染色體上基因H3/H4拷貝1而得到NAT突變菌株，通過(guò)檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)與生長(zhǎng)表型及部分敏感性試驗(yàn)，表明H3/H4基因缺失1個(gè)拷貝后并不會(huì)對(duì)酵母的正常生長(zhǎng)造成影響，這既為第2步XIV號(hào)染色體組蛋白定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)奠定了基礎(chǔ)，又可排除突變后表型的差異是因?yàn)槿笔Я?個(gè)拷貝而引起的可能性。第2步替換由于H3/H4定點(diǎn)突變基因較長(zhǎng)，因此筆者對(duì)含有突變基因的質(zhì)粒pBB6-Hhf2-hht2K56A進(jìn)行酶切并獲得含有H3/H4左右同源臂的H3/H4基因H3K56A定點(diǎn)突變基因，同樣通過(guò)乙酸鋰轉(zhuǎn)化法得到H3K56A突變株。通過(guò)本研究提供的方法進(jìn)行突變體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化效率較高，操作簡(jiǎn)便，可以成功得到組蛋白定點(diǎn)突變菌株，這為研究組蛋白H3K56ac修飾的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

通常情況下，微生物都有能力應(yīng)答外界不良環(huán)境的刺激，這些應(yīng)激幾乎是微生物都具有的基本能力，包括營(yíng)養(yǎng)水平的改變、滲透壓失衡、氧化應(yīng)激和溫度變化等不良條件[18]。多細(xì)胞生物及可以運(yùn)動(dòng)的生物體一般都可以通過(guò)能動(dòng)的位置的或生理機(jī)能的調(diào)節(jié)改變來(lái)避免這些不利的生存環(huán)境，但是對(duì)于單細(xì)胞生物如酵母來(lái)說(shuō)，它們受外界環(huán)境的支配，要么適應(yīng)這種環(huán)境，要么死亡[19]。釀酒酵母是一種典型的模式生物，其對(duì)環(huán)境壓力應(yīng)答的研究是真核細(xì)胞生物學(xué)研究的重要組成部分，而轉(zhuǎn)錄激活在這個(gè)過(guò)程中起重要作用[20]。目前對(duì)組蛋白修飾在酵母抗逆過(guò)程中所起作用研究甚少，本研究對(duì)H3K56A定點(diǎn)突變菌株進(jìn)行高鹽、高溫敏感性試驗(yàn)，對(duì)組蛋白修飾在外界不良環(huán)境脅迫下所起作用進(jìn)行初步探索，為組蛋白H3K56位點(diǎn)修飾的研究提供了新的參考。

4結(jié)論

本研究通過(guò)兩步替換法成功獲得了組蛋白H3K56A突變株，使得組蛋白H3K56位點(diǎn)不能被乙酰化修飾，為構(gòu)建組蛋白修飾突變體提供了1種簡(jiǎn)易而高效的方法，并且為研究組蛋白H3K56ac修飾的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)高鹽、高溫敏感性試驗(yàn)表明，酵母H3K56ac與酵母抗高溫、高鹽機(jī)制有關(guān)。

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