陳培珍，劉俊劭，劉瑞來，葛小寶（福建省高校綠色化工技術(shù)重點實驗室，武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

丹桂花總黃酮超聲輔助提取及抗氧化性的研究

陳培珍，劉俊劭，劉瑞來，葛小寶
（福建省高校綠色化工技術(shù)重點實驗室，武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

摘要：以干丹桂花為原料，利用超聲輔助提取丹桂花中的總黃酮。研究超聲時間、超聲脈沖間隙時間、超聲功率、料液比、乙醇濃度、提取溫度等因素對丹桂花黃酮提取率的影響，并最終確定最佳工藝條件為：超聲時間15 min，超聲工作時間/超聲間隙時間比為5∶2，超聲溫度60℃，料液比1∶30（g/mL），超聲功率60 W，乙醇濃度40%。通過羥自由基和超氧陰離子自由基的清除實驗，表明提取的黃酮具有和BHT相當(dāng)?shù)目寡趸钚浴?/p>

關(guān)鍵詞：丹桂；總黃酮；超聲輔助提??；自由基；抗氧化

桂花（Osmanthus fragrans Lour）又名木犀、九里香、金栗，是我國十大傳統(tǒng)名花之一，我國桂花主要有金桂、銀桂、丹桂和四季桂四大品種群約100多個品種。福建省浦城縣栽培丹桂歷史悠久，被譽(yù)為丹桂之鄉(xiāng)，現(xiàn)栽種面積突破0.4萬公頃，居全國首位。桂花具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，其花可以提取香料，也可熏制花茶。目前發(fā)現(xiàn)桂花中黃酮、蛋白質(zhì)、脂肪含量非常豐富，也含多種維生素、微量元素、胡蘿卜素、花青素等成分，作為食品具有清除體內(nèi)毒素及通宿便、凈化身心、平衡神經(jīng)系統(tǒng)，達(dá)到提神的作用；還具有抗癌、祛風(fēng)散寒、潤脾醒胃、增進(jìn)食欲及減肥之功效，利用桂花原料制備天然黃酮類抗氧化產(chǎn)品具有潛在應(yīng)用價值[1-4]。

本研究利用干燥丹桂花為原料，采用超聲波輔助提取法制備總黃酮類產(chǎn)品，并通過單因素試驗確定其最佳提取工藝條件；同時，通過清除羥基自由基和超氧陰離子自由基試驗，測定丹桂花總黃酮的清除率，評價桂花總黃酮對自由基的清除能力，為丹桂花黃酮的提取、保健等資源綜合開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1　主要儀器與材料

UV-2550紫外可見分光光度計：日本Shimadzu公司；BILON-500超聲波萃取儀：上海比朗儀器有限公司；RT-04藥材粉碎機(jī)：浙江武義屹立工具有限公司。

無水乙醇、無水乙醚、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、過氧化氫、鄰苯三酚、蘆丁、BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）、水楊酸等：試劑均為AR；三羥甲基氨基甲烷：生化試劑；丹桂花系由福建浦城木犀園營養(yǎng)食品有限公司提供。

2　試驗方法

2.1樣品的預(yù)處理

將干桂花，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，稱取15.00g，裝入索氏脂肪提取器，按料液比1∶20（g/mL），以無水乙醇脫脂肪和色素2 h，得到處理后的桂花粉末放入真空干燥箱中60℃烘24 h，裝于棕色磨口試劑瓶中備用。

2.2桂花黃酮含量的測定

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

黃酮含量的測定采用NaNO2-Al（NO3）3分光光度法[5-6]。

準(zhǔn)確配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.505 mg/mL于50 mL容量瓶中，準(zhǔn)確移取0、1、2、4、6、8、10 mL至50 mL的容量瓶中，加60%乙醇溶液補(bǔ)充至12mL，加入5%亞硝酸鈉1.4 mL，搖勻，放置5 min后加入10%的硝酸鋁1.4 mL，搖勻，放置5 min后加入4%的氫氧化鈉10 mL，搖勻，用60%乙醇溶液定容至50 mL，30 min后，在400 nm～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定508 nm處為最大吸收波長，測定蘆丁溶液的吸光度，以二次水作空白參比。以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=11.419х-0.006 9，R2=0.999 7。

2.2.2桂花總黃酮的超聲輔助提取及含量的測定[7-9]

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量預(yù)處理后的丹桂粉末于超聲反應(yīng)器中，在一定的超聲時間、工作/間歇時間比、乙醇濃度、功率、溫度、料液比等因素處理后，經(jīng)過減壓抽濾得到提取液，準(zhǔn)確吸取0.25 mL提取液于25 mL容量瓶中，按2.2.1的操作方法測定吸光度y，根據(jù)回歸方程，得到丹桂總黃酮濃度x，按下式計算總黃酮提取率：

提取率/%=（xV/m）×100

式中：V為提取液的總體積，mL；m為稱量桂花的準(zhǔn)確質(zhì)量，g。

2.3羥自由基清除活性

利用Fenton反應(yīng)[10]，H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，當(dāng)在體系中存在水楊酸情況下就能捕捉·OH，延長其存在時間，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在波長510 nm左右有強(qiáng)吸收，若在反應(yīng)體系中加入具有清除·OH功能的物質(zhì)，就會和水楊酸爭奪·OH，而使有色產(chǎn)物的生成量減少，這樣，我們可以利用在此條件下測定體系的吸光度值（此值可作為清除一定量的羥基自由基的A值）來測定黃酮類化合物對羥基自由基的清除效率。在25 mL的比色管中依次移取2 mL的2 mmol/L硫酸亞鐵溶液和2 mL的6 mmol/L雙氧水溶液，加入5 mL不同濃度的提取液，混合均勻后用6 mmol/L水楊酸的乙醇溶液定溶至刻度。在36℃～37℃的恒溫水中反應(yīng)15 min后在分光光度計上測其A值。

樣品自由基的清除率可根據(jù)下式進(jìn)行計算：

式中：A0為空白對照液吸光度，A0值的測定（以純水為參比）；AX為加入一定體積的提取液后的吸光度；AX0為本底吸光度。

2.4超氧陰離子自由基清除能力的檢測[11]

取0.05 mol/L，pH=8.2的Tris-HCL緩沖液于4.5 mL置于10 mL干燥具塞比色管中，在25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入配好的樣品溶液，然后加入0.4 mL的25mmol/L鄰苯三酚，混勻后，在25℃水浴中反應(yīng)4min，立即加入2滴8 mol/L HCl終止反應(yīng)，以蒸餾水為空白，在327 nm處測定吸光度A。

其清除效率可根據(jù)下式進(jìn)行計算：

式中：A0為空白的吸光度值；Ai為樣品的吸光度值。

3　結(jié)果與分析

3.1浸提方法的比較

準(zhǔn)確稱取脫脂后的干丹桂樣品2 g用60%乙醇溶液，在料液比1∶30（g/mL）、溫度50℃、提取時間30 min的條件下進(jìn)行試驗，分別以直接浸提法、連續(xù)超聲波輔助提取法（超聲功率60 W）和脈沖超聲波輔助提取法（超聲功率60 W，超聲工作時間5 s，間隙時間1 s）進(jìn)行提取，比較總黃酮的提取率，試驗結(jié)果如圖1所示。

圖1　浸提方法的比較Fig.1　Comparison of extraction method

結(jié)果表明超聲輔助法對桂花黃酮的提取有顯著地提升效果，脈沖超聲比連續(xù)超聲提取的效果更好。

3.2超聲提取桂花中總黃酮試驗結(jié)果與分析

3.2.1超聲時間/間隙時間比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取樣品5份2.00 g的樣品于反應(yīng)器內(nèi)，加60%乙醇60 mL[料液比 1∶30（g/mL）]，用超聲功率60 W，溫度50℃，分別以25 min（5 s/1 s、5 s/2 s、5 s/3 s、5 s/4 s、5 s/5 s）的超聲波條件進(jìn)行提取，過濾取得上清液，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖2。

圖2　超聲間隔時間比對黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic time interval on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

可以看出在超聲工作時間5 s，間歇時間2 s條件下提取效果較好，超聲強(qiáng)化萃取主要由空化作用和機(jī)械作用共同強(qiáng)化的效果，相對于連續(xù)超聲，脈沖超聲不斷重復(fù)超聲的產(chǎn)生和停歇，對植物的細(xì)胞產(chǎn)生不斷拉伸和收縮的過程，加大對細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破壞程度，能夠更大提高提取效率。過大的間歇時間使超聲作用的實際時間減少也不利超聲的作用。

3.2.2超聲時間對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份2 g的樣品，加入60%乙醇60 mL，在超聲功率60 W，溫度50℃，工作間歇時間比5 s/2 s條件下，分別以5、10、15、20、25、30 min的超聲時間進(jìn)行丹桂總黃酮的提取并測其含量，結(jié)果見圖3。

圖3　超聲時間對提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic time on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

結(jié)果如圖所示當(dāng)提取時間大于15 min后提取率的變化明顯趨緩，表明提取接近完全，過分增大提取時間導(dǎo)致部分黃酮分解，致使提取率下降，故取提取時間為15 min。

3.2.3超聲功率對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份2.00g的樣品，加入60%乙醇60mL，在溫度50℃，超聲時間15 min，工作間歇時間比5 s/2 s的條件下，分別以40、60、80、100、120 W的超聲功率進(jìn)行丹桂總黃酮的提取并測其含量，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對提取率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic power on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

由圖4可見，隨著超聲功率的升高，黃酮提取率隨之升高，功率達(dá)到60 W時，黃酮提取率最大。繼續(xù)增大功率，總黃酮提取率下降。這可能因為超聲功率增大，黃酮分子內(nèi)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致黃酮含量的降低。

3.2.4料液比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份2 g的樣品，加入一定量的60%乙醇，設(shè)定料液比（g/mL）為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在溫度50℃，超聲功率60 W，超聲時間15 min，工作間歇時間比5 s/2 s的條件下，進(jìn)行丹桂總黃酮的提取并測其含量，結(jié)果見圖5。

圖5　料液比對提取率的影響Fig.5　Effect of ratio of material to solvent on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

由圖5可看出，在料液比為1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）內(nèi)，總黃酮提取率隨著料液比的增大而提高，當(dāng)料液比大于1∶30（g/mL）后，提取率開始下降這是因為原料量一定時，溶劑用量大，在提取中隨著溶劑用量的提高黃酮的濃度較小，黃酮容易從原料中擴(kuò)散到溶液中，隨著溶劑用量繼續(xù)增大，溶度變化影響減小，溶劑量的增大增加了超聲波破碎細(xì)胞的阻力，從而使黃酮的提取率降低。

3.2.5乙醇濃度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份2 g的樣品，分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇60 mL，在溫度50℃，超聲功率60 W，超聲時間15 min，工作間歇時間比5 s/2 s的條件下，進(jìn)行黃酮的提取并測其含量，結(jié)果見圖6。

圖6 乙醇濃度對提取率的影響Fig.6　Effect of ethanol concentration on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

由圖6可以看出，提取率隨乙醇濃度的增加先增加后減少。黃酮是一大類物質(zhì)，部分是水溶性的，部分是醇溶性的[12]，許多學(xué)者認(rèn)為植物黃酮類化合物在乙醇溶液的溶解與其極性有關(guān)[13-15]，當(dāng)乙醇溶液的極性與植物黃酮類化合物的極性相似時具有較高的提取率?？赡芤虻す饦悠分械狞S酮類化合物與40%～50%乙醇濃度的極性相近，故能得到較高的提取率。

3.2.6提取溫度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份2 g的樣品，加入40%乙醇60 mL，在超聲功率60 W，超聲時間15 min，工作間歇時間比5 s/2 s的條件下，分別以30、40、50、60、70℃的超聲溫度進(jìn)行丹桂總黃酮的提取并測其含量，結(jié)果見圖7。

試驗結(jié)果可知溫度由30℃升到50℃提取率有較為明顯的升高，大于50℃提取率變化趨緩，當(dāng)高溫時提取率反而下降，這可能是因為在一定溫度范圍內(nèi)升高溫度有利于黃酮的溶出；在溫度較高時可能導(dǎo)致黃酮的水解或變性。

3.3桂花黃酮提取物抗氧化性能測定

3.3.1羥基自由基的清除

丹桂黃酮提取物和用作陽性對照的BHT對羥基自由基的清除能力對比試驗，分別準(zhǔn)確移取1、2、4、6、8、10 mL丹桂總黃酮提取液及濃度為6 mg/mL的BHT溶液至25 mL容量瓶中，稀釋至刻度，根據(jù)2.3方法測定丹桂總黃酮對羥基自由基的清除率，結(jié)果見圖8。

圖7　超聲提取溫度對提取率的影響Fig.7　Effect of ultrasonic temperature on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

圖8　丹桂黃酮對羥基自由基的清除作用Fig.8　Hydroxyl radical scavenging effect of flavonoid glycoside from Osmanthus fragrans var aurantiacus

測定結(jié)果如圖8所示，可知：提取物和BHT的抗氧化活性都隨著濃度的增加而提高。BHT比提取物清除羥基自由基的能力略高。

3.3.2超氧陰離子的清除

分別移取丹桂總黃酮和6 mg/mLBHT溶液0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mL于2 mL比色管中，定容；根據(jù)2.4方法二測定丹桂總黃酮和BHT對超氧陰離子的清除率，試驗結(jié)果見圖9。

由樣品提取物和BHT對超氧陰離子的清除效果比較來看，提取物對超氧陰離子的清除能力要好于此濃度下BHT的清除能力。

4　結(jié)論

采用超聲輔助溶劑法提取丹桂花總黃酮，以提取率為評價指標(biāo)，對提取工藝條件進(jìn)行試驗研究，確定丹桂總黃酮較佳提取工藝條件為：超聲時間15 min，超聲工作時間5 s，超聲間隙時間2 s，以40%乙醇為提取溶劑，提取料液比1∶30（g/mL），提取溫度50℃，超聲功率為60 W，在此條件下丹桂總黃酮得率可達(dá)17.70%。

通過羥基自由基、超氧陰離子自由基體外抗氧化模型的試驗研究，研究結(jié)果表明：丹桂黃酮抗氧化活性隨濃度的升高而增大，在清除羥基自由基試驗中，丹桂黃酮的清除能力略低于BHT，而對超氧陰離子清除能力由于BHT，可以看出丹桂花黃酮具有潛在開發(fā)價值的天然抗氧化劑。

圖9　丹桂黃酮對超氧陰離子的清除作用Fig.9　Superoxide anion radical scavenging effect of flavonoidglycoside from Osmanthus fragrans var aurantiacus

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.012

收稿日期：2014-08-13

基金項目：武夷學(xué)院對接南平產(chǎn)業(yè)發(fā)展科研專項（2011DJ10）

作者簡介：陳培珍（1968—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的提取及其分析。

Study on Ultrasonic-assisted Extraction of the Total Flavonoids in Osmanthus Fragrans Var Aurantiacus and Its Antioxidative Activity

CHEN Pei-zhen，LIU Jun-shao，LIU Rui-lai，GE Xiao-bao
（College of Ecological and Resources Engineering，Key Laboratory of Green Chemical Technology of Fujian Province University，Wuyi University，Wuyishan 354300，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：The extraction of flavonoids from dry Osmanthus fragrans var aurantiacus with ultrasonic wave was studied.With extraction rate as an index，ultrasonic extracted time，pulse ultrasonic intermittent time，ultrasonic power，material/extraction solution ratio，ethanol concentration and ultrasonic extracted temperature etc.The optimum extraction condition were as follows：ultrasonic extracted time 15 min，ultrasonic pulse duration time 5 s，pulse interval time 2 s，ultrasonic power 60 W，material/extraction solution ratio 1∶30（g/mL），ethanol concentration 40%and ultrasonic extracted temperature 60℃.The antioxidative activity was evaluated based on hydroxyl free radical and surperoxide anion radical scavenging capacity.The results showed that flavonoid from Osmanthus fragrans var aurantiacus and BHT had the same antioxidant activity.

Key words：Osmanthus fragrans var aurantiacus；total flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；radical；antioxidation