弓玉紅，田晶（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西離石033000）

納豆制備及冷凍干燥保護(hù)劑的篩選和優(yōu)化研究

弓玉紅，田晶
（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西離石033000）

摘要：從甘油、蔗糖、抗壞血酸、葡聚糖和檸檬酸鈉5種保護(hù)劑中，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出了甘油、抗壞血酸和檸檬酸鈉這3種對(duì)納豆菌和納豆激酶具有較好保護(hù)效果的保護(hù)劑，然后將這3種保護(hù)劑通過(guò)正交試驗(yàn)選出一組效果較好的保護(hù)劑組合：甘油5%、抗壞血酸0.5%、檸檬酸鈉5%，在此條件下納豆激酶相對(duì)酶活可達(dá)1 171.569 IU/mL，納豆菌的存活可達(dá)9.5×108CFU/mL。

關(guān)鍵詞：納豆；冷凍干燥保護(hù)劑；篩選；優(yōu)化

納豆（natto）源于中國(guó)，是日本一種獨(dú)特的大豆傳統(tǒng)食品，類似中國(guó)的豆豉，它的制作簡(jiǎn)單，風(fēng)味獨(dú)特，價(jià)格低廉[1]，納豆不僅具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且含有多種生理活性物質(zhì)，如納豆激酶、納豆菌等，賦予納豆多種保健功能，如溶血栓、抗腫瘤、降血壓等作用，因此開(kāi)發(fā)納豆食品，會(huì)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[2]。

冷凍干燥是目前保持蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)生物活性的一種有效的方法。但是，冷凍干燥過(guò)程中會(huì)造成細(xì)胞的損傷，及酶的損傷、變性。在冷凍干燥時(shí)加入適宜的保護(hù)劑，可以在很大程度上減輕或避免冷凍干燥對(duì)細(xì)胞及酶等生物大分子帶來(lái)的損傷。本研究主要是冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)劑對(duì)納豆菌存活和納豆激酶酶活的影響進(jìn)行研究。采用甘油、抗壞血酸、蔗糖、葡聚糖和檸檬酸鈉作為凍干保護(hù)劑，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選效果較好的保護(hù)劑，再通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳保護(hù)劑組合。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

納豆菌（Bacillus natto H106）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室；蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%、瓊脂2%；尿激酶（1 280 IU/支）：中國(guó)藥物生物制品研究所；凝血酶、牛纖維蛋白原（1 000 IU/支）：Sigma公司；瓊脂糖、蔗糖（分析純）、甘油（食品級(jí)）、檸檬酸鈉（食品級(jí)）、抗壞血酸（分析純）、葡聚糖（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.2主要儀器

真空冷凍干燥試驗(yàn)機(jī)（JDG-0.2）：蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；不銹鋼手提式壓力滅菌器（YWQ-LS-18S1）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-500型）：北京光明醫(yī)療儀器廠；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫干燥箱（DFZ-05）：北京醫(yī)療機(jī)械廠；漩渦振蕩器：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市科析儀器有限公司；照相顯微鏡（BX51M）：Olympus。

1.3方法

1.3.1納豆菌的活化及培養(yǎng)

按蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%的比例配制液體培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下，挑取一環(huán)納豆菌接入液體培養(yǎng)基中，后在37℃的搖床上震蕩培養(yǎng)24 h，使菌液濃度達(dá)到108cfu/mL。納豆菌菌落及其菌體形態(tài)的觀察：將納豆菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出單個(gè)菌落，革蘭氏染色，用顯微鏡觀察。

1.3.2納豆的制備

洗凈大豆后用3倍的水量浸泡24 h，室溫15℃后瀝水。在121℃溫度下蒸煮大豆20 min，煮到易用手捏碎，冷卻備用。在無(wú)菌條件下，將接好種的液體培養(yǎng)基按3%的接種量噴灑于大豆表面，攪拌均勻，鋪成3 cm～5 cm的薄層，37℃培養(yǎng)24 h[3-5]。

1.3.3納豆激酶酶活的測(cè)定方法

納豆激酶酶活性的測(cè)定方法有纖維蛋白平板法、TAME底物法等多種方法，但目前較為常用的是纖維蛋白平板法，其原理是以凝血酶和纖維蛋白原制成人工血栓平板，注入納豆激酶，用溶圈面積的大小來(lái)表示納豆激酶的溶纖維活性的大小[6]。本試驗(yàn)采用纖維蛋白平板法測(cè)定納豆激酶的酶活性。

1.3.3.1纖維蛋白平板的制作

參照Astrup[7]等報(bào)道的纖維蛋白平板法，試驗(yàn)過(guò)程中需要臨時(shí)配制試劑，平板最好當(dāng)天使用。納豆激酶的酶活性以測(cè)得的纖維蛋白溶解圈的面積來(lái)表示。

1.3.3.2酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-9]

以相對(duì)于尿激酶的活力單位來(lái)表示納豆激酶活力的測(cè)定的。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同的濃度（100、150、200、250、300 IU/mL），在纖維蛋白平板上用打孔器打一系列直徑3 mm的孔，移液器各取10 μL不同濃度的尿激酶溶液注入孔中，靜置10 min，放入37℃恒溫培養(yǎng)18 h。分別測(cè)定纖維蛋白溶解圈的兩個(gè)相互垂直直徑，將其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積，并根據(jù)纖維蛋白溶解圈與尿激酶的活力單位的面積來(lái)制作酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線，以直徑乘積為橫坐標(biāo)，酶活為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

從繪制的圖中可以看出，尿激酶的酶活與其溶圈面積成線性關(guān)系，其方程為：y=224.8x-17.623，根據(jù)此線性方程，可以計(jì)算出納豆中納豆激酶的相對(duì)酶活。（y表示納豆激酶相對(duì)酶活，x表示溶圈的面積）

1.3.3.3納豆激酶酶活力的測(cè)定[10]

在無(wú)菌環(huán)境中稱取5 g納豆，加入10 mL無(wú)菌水，放入滅過(guò)菌的研缽中充分研磨30 min，用無(wú)菌紗布過(guò)濾。取濾液10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，37℃的恒溫培養(yǎng)18 h后，分別量取溶圈的兩個(gè)相互垂直直徑，其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積，數(shù)值代入酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出相當(dāng)?shù)哪蚣っ竼挝唬↖U/mL），即為納豆激酶的酶活力。

圖1 尿激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of urokinase activity

1.3.4納豆菌活菌數(shù)的測(cè)定

納豆菌的存活率采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[11]。

1.3.4.1冷凍干燥前活菌數(shù)的測(cè)定

在無(wú)菌環(huán)境中稱取5 g納豆，加入10 mL無(wú)菌水，放入滅過(guò)菌的研缽中充分研磨30 min，用無(wú)菌紗布過(guò)濾。取得的濾液，用滅過(guò)菌的移液管取1mL濾液，進(jìn)行梯度稀釋到10-7然后取0.5 mL稀釋液到裝有凝固的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，涂勻，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，計(jì)數(shù)。

1.3.4.2凍干后活菌數(shù)的測(cè)定

在無(wú)菌條件下，稱取1.75 g干納豆，加入13.25 mL無(wú)菌水，在研缽中充分研磨30 min。然后按照1.2.4.1的操作進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

論文中納豆菌數(shù)均為0.5 mL樣品稀釋液時(shí)的活菌數(shù)（n），若換算成每克干納豆的納豆菌活菌數(shù)（107個(gè)/g）= n×2×（13.25+1.75）/1.75；納豆激酶酶活力均為相對(duì)尿激酶酶活力（m），若換算成每克干納豆的納豆激酶酶活（IU/g）=m×（13.25+1.75）/1.75。

1.3.5冷凍干燥保護(hù)劑的篩選和優(yōu)化

參照文獻(xiàn)報(bào)道[10，12]，采用甘油、抗壞血酸、蔗糖、葡聚糖和檸檬酸鈉為保護(hù)劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳的復(fù)合保護(hù)劑組合。

1.3.5.1單因素試驗(yàn)

把新鮮納豆放在-20℃冰箱中凍1 h，拿出在無(wú)菌環(huán)境中將甘油、蔗糖、抗壞血酸等保護(hù)劑按不同量加入，鋪成一層放入凍干機(jī)中，樣品以真空度為20 Pa～30 Pa、冷阱溫度為-45℃、加熱擱板溫度為40℃的條件下冷凍干燥12 h，4℃冷藏備用。測(cè)出凍干前后納豆菌的活菌數(shù)和納豆激酶的酶活力，由此篩選得到保護(hù)效果較好的凍干保護(hù)劑。

1.3.5.2正交試驗(yàn)優(yōu)化保護(hù)劑組合

按不同比例復(fù)配篩選出的保護(hù)效果較好的保護(hù)劑進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1納豆菌的形態(tài)特征

納豆菌的菌落及其菌體的形態(tài)特征如圖2所示。

圖2　納豆菌的菌落和菌體形態(tài)特征圖Fig.2　The colony and morphological characteristics graph of Bacillus natto

從圖2中可以看出，納豆菌菌落呈乳白色，圓形，表面粗糙且有皺褶，微突起，邊緣不整齊，無(wú)光澤。革蘭氏染色后呈藍(lán)色，及為陽(yáng)性，有芽孢，呈橢圓或柱狀。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1蔗糖對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的蔗糖為保護(hù)劑，測(cè)定納豆菌活菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活力，結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同濃度的蔗糖對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響Fig.3　Influence of different concentrations of sucrose on Bacillus natto and nattokinase

由圖3數(shù)據(jù)得到，蔗糖對(duì)納豆菌和納豆激酶具有一定的保護(hù)效果[13]。但是蔗糖不適合糖尿病人，所以不用蔗糖作為納豆的保護(hù)劑成分。

2.2.2甘油對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的甘油為保護(hù)劑，測(cè)定納豆菌活菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活力，結(jié)果如圖4所示。

由圖4數(shù)據(jù)得到，甘油在納豆菌和納豆激酶在凍干過(guò)程中起到較好的保護(hù)作用[12]。并隨著甘油濃度的增大，納豆激酶酶活力和納豆菌的存活都有提高，但當(dāng)甘油添加量分別達(dá)到5%和10%后，對(duì)納豆菌的存活和納豆激酶酶活力的影響不再顯著，本研究選擇添加量0%、5%、10%3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4　不同濃度的甘油對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響Fig.4　Influence of different concentrations of skim milk powder to Bacillus natto and nattokinase

2.2.3檸檬酸鈉對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的檸檬酸鈉為保護(hù)劑，測(cè)定納豆菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響Fig.5　Influence of different concentrations of xylitol on Bacillus natto and nattokinase

由圖5可以看出，檸檬酸鈉對(duì)納豆菌和納豆激酶有一定的保護(hù)作用。由于檸檬酸鈉適合糖尿病人食用，因此選用檸檬酸鈉添加量為0%、5%、10%3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4抗壞血酸對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的抗壞血酸為保護(hù)劑，測(cè)定納豆菌的數(shù)量和納豆激酶的酶活，結(jié)果如圖6所示。

圖6　不同濃度的抗壞血酸對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響Fig.6　Inflence of different concentrations of ascorbic acid on Bacillus natto and nattokinase

由圖6看出，抗壞血酸對(duì)納豆菌和納豆激酶的保護(hù)作用較好[14]?？箟难岬奶砑恿糠謩e達(dá)到0%、0.5%、1%時(shí)納豆菌的存活和納豆激酶的酶活均顯著增加，抗壞血酸的添加量分別達(dá)到1%和1.5%時(shí)，納豆菌的存活和納豆激酶的酶活力均未顯著增加，選擇添加量0%、0.5%、1%3個(gè)水平做正交試驗(yàn)。

2.2.5葡聚糖對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響

以不同濃度的葡聚糖為保護(hù)劑，測(cè)定納豆激酶的酶活和納豆菌的數(shù)量，結(jié)果如圖7所示。

圖7　不同濃度的葡聚糖對(duì)納豆菌和納豆激酶的影響Fig.7　Influence of different concentrations of lactose to Bacillus natto and nattokinase

由圖7數(shù)據(jù)得到葡聚糖對(duì)納豆菌和納豆激酶在有一定的保護(hù)作用，但效果并不十分顯著，所以不選擇葡聚糖作為本試驗(yàn)的凍干保護(hù)劑。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

選擇甘油的添加量A（%）、抗壞血酸的添加量B （%）和檸檬酸鈉的添加量C（%）為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1所示，正交試驗(yàn)結(jié)果表見(jiàn)表2所示。

表1　L（934）因素水平表Table 1　Levels and factors of conditions L（934）

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Result and analysis of orthogonal test

續(xù)表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Continue table 2　Result and analysis of orthogonal test

由正交表2可知，對(duì)于納豆菌活菌數(shù)來(lái)說(shuō)，9號(hào)處理最好，即納豆菌活菌數(shù)最高，其組合為A3B3C2；根據(jù)極差分析和直觀分析圖可知，各因素對(duì)納豆菌的影響順序?yàn)锳（甘油）、B（抗壞血酸）、C（檸檬酸鈉），最佳組合為A3B2C3。

對(duì)于納豆激酶酶活來(lái)說(shuō)，5號(hào)處理最好，即納豆激酶酶活最高，其組合為A2B2C3；根據(jù)極差大小和直觀分析圖可知，各因素對(duì)納豆激酶的影響順序?yàn)锳（甘油）、C（檸檬酸鈉）、B（抗壞血酸），最佳組合為A2B2C2。

兩個(gè)最佳組合有差異，經(jīng)過(guò)實(shí)際驗(yàn)證，得出組合A3B2C3，納豆菌數(shù)9.7×108CFU/mL，而納豆激酶酶活力為1 119.865 IU/mL；組合A2B2C2，納豆菌數(shù)為9.5× 108CFU/mL，納豆激酶的酶活力為1 171.569 IU/mL，從實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果比較看，雖然A2B2C2的納豆菌有所減少，但是它的納豆激酶酶活力提高了。因此，最終選擇A2B2C2組合作為納豆的凍干保護(hù)劑，即甘油5%，抗壞血酸0.5%，檸檬酸鈉5%。

3　結(jié)論

大豆在121℃下蒸煮20 min，按3%的接種量加入納豆菌，發(fā)酵24 h制成納豆。然后從甘油、蔗糖、抗壞血酸、葡聚糖和檸檬酸鈉5種保護(hù)劑中，先通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出了抗壞血酸、甘油和檸檬酸鈉3種對(duì)納豆激酶和納豆菌具有較好保護(hù)效果的保護(hù)劑，通過(guò)正交試驗(yàn)得到效果較好的保護(hù)劑組合：抗壞血酸0.5%、甘油5%、檸檬酸鈉5%，納豆激酶相對(duì)酶活力在此條件下可達(dá)1 171.569 IU，納豆菌的存活可達(dá)9.5×108cfu/mL，這為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.026

收稿日期：2015-10-15

作者簡(jiǎn)介：弓玉紅（1987—），男（漢），助教，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

Study on the Freeze-drying Protective Screening and Optimization and the Preparation of Natto

GONG Yu-hong，TIAN Jing
（Department of Life Science，Lvliang University，Lishi 033000，Shanxi，China）

Abstract：Through single factor，from glycerin，sucrose，ascorbic acid，glucan and sodium citrate selected threematerialswhichhavebetterprotectiveeffectonBacillusnattoandnattokinaseactivity.Thenthoughorthogonal tests selected the best combination of protective agents：5%glycerin，0.5%ascorbic acid，5%sodium citrate. Under these conditions，the nattokinase activity and survival of Bacillus natto reached 1 171.569 IU/mL and 9.5×108CFU/mL.

Key words：natto；cryprotectants；screening；optimize