張霞，溫華蔚，倪松，王禹，王淞，高琳，劉掘茫，鄭文杰（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

新等溫擴增技術檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌

張霞，溫華蔚，倪松，王禹，王淞，高琳，劉掘茫，鄭文杰*
（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

摘要：應用新型等溫擴增檢測技術——交叉引物等溫擴增結合免疫金標試紙條建立檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌的方法。針對小腸結腸耶爾森氏菌16-23S rDNA間區(qū)序列設計特異性引物及探針，用54株小腸結腸炎耶爾森氏菌及相近株細菌進行特異性試驗；通過純菌液計數(shù)、樣品中添菌檢測進行靈敏度驗證；對677份食品用傳統(tǒng)生化國標法進行比較檢測試驗。建立方法具有較好特異性；增菌液檢測靈敏度為101cfu/mL，當每25 g樣品中有100cfu菌時經(jīng)增菌步驟后即可檢出，樣品檢測同傳統(tǒng)檢測結果比較大致相符，沒有漏檢，假陽性率較低。建立的新型恒溫檢測方法可用于食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌初篩檢測。

關鍵詞：交叉引物等溫擴增技術；小腸結腸炎耶爾森氏菌；食品安全檢測

小腸結腸炎耶爾森氏菌是腸桿菌科、耶爾森菌屬的一個種，1974年被Bergey的細菌學鑒定手冊“第八版”列入腸桿菌科耶爾森氏菌屬[1]。小腸結腸炎耶爾森氏菌具有致病性強、致病范圍廣、容易傳播等特點。本菌所致疾病涉及臨床各科，按其病型可分為胃腸炎型和腸道外感染兩種，可導致嚴重的并發(fā)癥，如心肌炎、亞急性肝炎、結膜炎、眼炎、關節(jié)炎、急性腎小球腎炎、膽囊炎、尿道炎、腦膜炎，甚至可以引起敗血病，其死亡率可達34%～50%[2]。同時，由于該菌的生存條件極廣，生長溫度0℃～44℃，甚至報道在-2℃仍可生存，適應中強酸堿。因此，小腸結腸炎耶爾森氏菌是對人類身體健康具有極大威脅的一種細菌。

由于經(jīng)典檢驗方法耗時長、操作繁雜，為防控該菌的危害，保障人民的健康和生命安全，快速、特異性強的分子生物學診斷技術研究廣泛進行。目前針對小腸結腸炎耶爾森氏菌PCR方法[3-5]、實時熒光PCR技術[6]、芯片雜交技術[7]及環(huán)介導[8]、滾環(huán)恒溫擴增方法[9]等均有報道，成為日常規(guī)檢測的工具。

本研究旨在應用新型交叉引物等溫擴增技術[10]建立檢測方法，其結合免疫金試紙條檢測方法，避免LAMP方法結果檢測需要電泳使用EB危害、PCR產(chǎn)物污染等問題，將分子生物學檢測進一步推廣。

1　材料與儀器

1.1主要材料與試劑

Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；10×Bst buffer：New England Biolabs；dNTPs：Fermentas；MgSO4：Sigma；betaine：Sigma；核酸快速檢測試紙條：優(yōu)思達公司。

菌株采用4株ATCC和23株CMCC小腸結腸炎耶爾森氏菌標準菌株（涉及27個血清型），9株其它ATCC耶爾森氏菌屬標準菌和其它近緣菌屬18株ATCC標準菌株，詳見表1。

表1 試驗菌株Table 1　Bacterial strains for detection

1.2主要儀器與設備

PCR儀（Bio-rad，C1000 Touch）、離心機（Eppendorf，5417R）。

1.3方法

1.3.1引物及探針的設計

利用細菌16 s-23 s rDNA間區(qū)序列[11-12]（GenBank Accession No.AM286415）設計特異性引物見表2。

表2 檢測引物序列Table 2　Primers sequence for the detection

1.3.2反應體系和反應條件

各試劑濃度為：CR/CF引物各0.4μmol/L，DR/DF引物各0.8μmol/L，DF/DP各0.1 μmol/L，0.5 mmol/L dNTPs，Bst DNA酶6個單位，2 μL 10×Bst buffer，0.5 mol/L betaine，4 mmol/L MgSO4，1 μL DNA模板。

反應條件：63℃反應60 min。

1.3.3特異性試驗

對表1中菌株核酸樣本進行試驗，以證明交叉引物等溫擴增檢測方法是否具有通用性及特異性。

1.3.4靈敏度試驗

以小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC49397為試驗菌株，37℃培養(yǎng)16 h，取1 mL進行純菌液計數(shù)后10倍稀釋，按照CPA反應體系進行試驗。

1.3.5樣品添菌檢測

取經(jīng)證實不含目標菌的奶粉樣品A、B在增菌前分別添加101、100cfu/25 g小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC49397菌液1mL，混勻1min，加入增菌液225mL，37℃培養(yǎng)12 h，取1 mL樣品增菌液按照本研究方法進行檢測，未添加菌的樣品A、B作為空白對照，同時做細菌計數(shù)。

1.3.6實際樣品檢測

應用建立的CPA檢測方法，在出入境食品的日常檢測工作中和國家標準GB/T 4789.8-2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗》進行比較試驗，共進行677份5類不同樣品檢測工作。

2　結果與分析

2.1特異性試驗

54株實驗菌株進行特異性實驗，其中27株小腸結腸炎耶爾森氏菌（4株ATCC、23株CMCC標準菌株），檢測結果全部為陽性見圖1。

圖1　小腸結腸炎耶爾森氏菌交叉引物等溫擴增檢測Fig.1　CPA amplification for Y.enterocolitica strains

其顯示了部分陽性菌株檢測結果；另外27株陰性對照菌，包括9株ATCC耶爾森氏菌屬標準菌和其它近緣菌屬18株ATCC標準菌株，結果全部為陰性見圖2。

圖2 陰性對照菌檢測結果Fig.2 CPA amplification for non-Y.enterocolitica strains

表明近緣菌株都無假陽性出現(xiàn)，說明交叉引物等溫擴增結合免疫金標試紙條檢測方法特異性良好，而且對小腸結腸炎耶爾森氏菌全血清型具有很好的通用性。

2.2檢測靈敏度

2.2.1純菌液檢測

試驗菌株ATCC49397過夜培養(yǎng)后菌液濃度為8.6×108cfu/mL，用PBS對菌液進行10倍梯度稀釋至100cfu/mL數(shù)量級，各取1 mL提取DNA做實驗模板，進行靈敏度檢測，檢測結果見圖3。

圖3　小腸結腸炎耶爾森氏菌交叉引物等溫擴增純菌液靈敏度檢測Fig.3　Sensitivity of CPA detection for Y.enterocolitica pure culture

108cfu/mL～101cfu/mL菌液濃度時全部為陽性，100cfu/mL時，檢測結果為陰性。

2.2.2樣品添菌實驗

對準備添菌的空白樣品細菌計數(shù)，本底雜菌數(shù)為3.4×102cfu/g，向樣品中添菌8.6及86 cfu/25 g，經(jīng)12 h增菌后，取1 mL增菌液做CPA檢測，結果為陽性，說明在有其他干擾菌的情況下，樣品有目標菌100cfu/25 g時，經(jīng)增菌后可以檢出。

2.3實際樣品檢測

對本實驗室日常檢測的5類不同種類的677份食品樣品分別用傳統(tǒng)生化國標法與CPA兩種方法進行比較檢測試驗，結果見表3。

表3 實際樣品檢測結果Table 3　The detection result of samples

CPA陽性檢出高于國家標準方法。以國標法為基準方法進行CPA方法性能指標的評價，結果見表4。

表4CPA檢測性能指標評價結果Table 4　The reslut of CPA performance

CPA方法的假陰性率=0/17=0、假陽性率=7/653= 1.07%。

通過表4數(shù)據(jù)及該方法的假陰性率為0、假陽性率為1.07%，可以看出，同傳統(tǒng)的檢測結果大致相符，沒有漏檢情況，有可能出現(xiàn)假陽性，但發(fā)生率較低，說明CPA方法，對食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢測結果達到準確、可靠。

3　結論

目前國內(nèi)針對食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌檢測方法主要以國家標準為依據(jù)，該標準方法依賴于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定、血清學分型等實驗，一般的檢測周期在5 d～7 d左右，存在著檢驗周期長，工作量大等缺點，不再適用于日益增長的進出口食品貿(mào)易。隨著現(xiàn)代科學技術的不斷發(fā)展，特別是分子生物學的不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、特異、敏感的快速檢測方法，如熒光PCR法、基因芯片檢測方法等，但全部以大型的儀器設備和熟練的專業(yè)技能為前提，不適合于在基層及偏遠經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)應用，而目前食品安全的現(xiàn)狀是亟待提高基層及經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)的檢測實力。

等溫擴增檢測方法應運而生，為快速基因檢測提供了新的技術途徑，相較上述方法更具推廣性。通過本研究團隊建立致病菌CPA檢測體系發(fā)現(xiàn)，由于引物設計原理的不同，CPA法實際檢測靈敏度要略高于環(huán)介導等溫擴增方法[14-16]，但是由于樣品增菌后目標菌濃度一般可達到104cfu/mL左右，二者添菌試驗檢測靈敏度一致，均可應用于基層實驗室檢測以及樣品的快速篩選檢測。但是本研究檢測方法是結合免疫金標試紙條的方法，避免了環(huán)介導等溫擴增方法使用電泳時PCR產(chǎn)物的二次污染和EB對人體的危害，或是使用觀察沉淀、顏色變化造成的不客觀性，在結果觀察方面CPA明顯優(yōu)于環(huán)介導等溫擴增方法，所以比較易于在實際檢測工作中推廣使用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.030

收稿日期：2015-09-01

基金項目：質檢總局科研《生態(tài)港外來有害動植物疫病及食源性致病菌風險控制措施研究》資助（2014IK222）

作者簡介：張霞（1975—），女（漢），高級工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

*通信作者：鄭文杰（1969—），女，博士，研究員，研究方向：食品安全檢測。

Detection of Yersinia enterocolitica by a New Isothermal Amplification

ZHANG Xia，WEN Hua-wei，NI Song，WANG Yu，WANG Song，GAO Lin，LIU Jue-mang，ZHENG Wen-jie*
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：To develop a cross-priming amplification（CPA）combined with immunoblotting analysis method for the detection of Yersinia enterocolitica on food.Specific primers and probe were designed on the basis of six specific sequences in Y.enterocolitica 16S-23S rDNA internal transcribed spacer.The specificity of the method was evaluated by 54 different bacterial strains.The sensitivity of the method was evaluated by pure bacteria counted and the sample of adding Y.enterocolitica.To detect 677 samples comparing with the biochemical and culture-based assays.All of the Y.enterocolitica strains showed positive results，and the other bacteria gave negative results.The limit of detection of the CPA method was 101cfu/mL for bacteria in pure culture，and 100cfu per 25 g of sample with pre-enrichment.The result of sample detection was broadly consistent with the traditional detection，no omission，low false positive rate.This CPA method can be used for the rapid preliminary screening of Y.enterocolitica.

Key words：cross prime isothermal amplification；Y.enterocolitica；detection of food safety