崔銀風 張莉蕓 張改連 許珂 馬丹 郭東強 閆俊榮

中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎血清Dickkopf-1表達及相關(guān)性分析

崔銀風 張莉蕓 張改連 許珂 馬丹 郭東強 閆俊榮

目的 通過檢測中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎（ax-SpA）患者血清Dickkopf-1（DKK-1）水平，并進行相關(guān)性分析。方法 （1）采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測71例初次就診ax-SpA患者[其中51例強直性脊柱炎（AS）和20例非放射中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎（nr-axSpA）]、疾病對照組34例（其中14例類風濕關(guān)節(jié)炎、10例骨關(guān)節(jié)炎和10例痛風患者）和15例健康人，分別檢測血清DKK-1水平；（2）根據(jù)HLA-B27表達情況，將ax-SpA患者分為陽性組（48例）和陰性組（23例）；按照修訂紐約放射學骶髂關(guān)節(jié)炎分級標準，AS患者分為Ⅱ級（16例）、Ⅲ級（12例）和Ⅳ級（23例），比較不同分組血清DKK-1的表達差異；（3）分析血清DKK-1水平與ax-SpA患者臨床指標、炎性指標及影像學評分的相關(guān)性。結(jié)果 （1）AS患者血清DKK-1水平[（2133.9±432.9）ng/L]高于疾病對照組（RA、OA和Gout患者）和健康人[（1718.7±260.4）ng/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而低于nr-axSpA患者[（2303.9±289.4）ng/ L]，差異無統(tǒng)計學意義。（2）ax-SpA患者HLA-B27陽性血清DKK-1水平[（2150.47±440.9）ng/L]低于HLA-B27陰性患者[（2418.8±319.5）ng/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AS患者放射學骶髂關(guān)節(jié)炎Ⅳ級血清DKK-1水平[（1878.91±285）ng/L]低于Ⅱ級[（2248.18±365.53）ng/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Ⅲ級血清DKK-1水平分別與Ⅱ級[（2248.18±365.53）ng/L]、Ⅳ級[（1878.91±285）ng/L]比較，差異無統(tǒng)計學意義。（3）血清DKK-1水平與

ax-SpA患者病程(r=-0.424,P=0.0001)、BASMI(r=-0.264,P=-0.026)和AS患者mSASSS評分(r=-0.581,P=0.023)呈負相關(guān)，而與ax-SpA患者臨床指標、炎性指標及SPARCC評分無相關(guān)性。結(jié)論 血清DKK-1水平隨著漸進骨化程度的加重呈下降趨勢，可能是AS發(fā)生關(guān)節(jié)強直和骨贅形成的一個重要因素；血清DKK-1水平可以作為評價AS骨化程度的潛在生物學標志物之一。

強直性脊柱炎；中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎；Dickkopf-1；骶髂關(guān)節(jié)X線；骶髂關(guān)節(jié)磁共振成像

中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎（axial spondyloarthropathy，ax-SpA）累及骶髂關(guān)節(jié)和脊柱為主，包括強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）和非放射中軸型脊柱關(guān)節(jié)?。╪on-radiogrphic axial spondyloarthropathy，nr-axSpA）。AS是一種慢性炎性風濕性疾病，疾病進展情況個體差異很大所以尋找預(yù)測疾病進展的生物標志物非常必要。其中12% nr-axSpA患者在2年內(nèi)進展為AS[1]，有學者認為AS和nr-axSpA是一種疾病（ax-SpA）的兩個階段[2]，但一些數(shù)據(jù)顯示一部分比例的中軸型SpA患者可能永遠不會出現(xiàn)X線骶髂關(guān)節(jié)炎。有的AS患者在發(fā)病短期內(nèi)就會出現(xiàn)關(guān)節(jié)融合和脊柱強直，而有些患者長期患病卻未出現(xiàn)骨化現(xiàn)象。漸進性骨化必然導(dǎo)致AS患者致畸致殘，不僅造成勞動力的喪失，而且嚴重影響患者的生活質(zhì)量。目前AS骨化機制尚未明確，初始階段顯示為骨吸收，成骨的晚期階段則主要由Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控并介導(dǎo)新骨形成。DKK-1是Wnt信號通路的抑制因子。已有實驗動物研究表明，封閉DKK-1發(fā)生骶髂關(guān)節(jié)強直的現(xiàn)象[3]。DKK-1也參與以骨形成為原型的疾病即AS骨重塑的發(fā)病過程中。目前DKK-1與ax-SpA的相關(guān)研究較少，為了幫助臨床判斷病情進展提供依據(jù)，我們設(shè)立了此項研究。本研究探討血清DKK-1在ax-SpA患者的表達以及相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2013年5月～2014年1月就診于山西醫(yī)學科學院山西大醫(yī)院風濕免疫科門診及住院的51例AS患者和20例nr-axSpA患者臨床、實驗室及影像學資料（包括1個月之內(nèi)的骶髂關(guān)節(jié)X線和MRI）。由專業(yè)放射科及磁共振成像醫(yī)師閱片，其中20例AS患者脊柱X線片顯示骨贅形成，行修改Stoke強直性脊柱炎脊柱評分（mSASSS評分）[4]和

42例ax-SpA患者MRI示骶髂關(guān)節(jié)面骨髓水腫，采用加拿大脊柱關(guān)節(jié)病研究協(xié)會評分（SPARCC評分）[5]，并記錄評分情況。AS診斷符合修訂紐約標準并有放射學骶髂關(guān)節(jié)炎（至少雙側(cè)Ⅱ級或單側(cè)Ⅲ級）和nr-axSpA診斷符合ax-SpA的分類標準但無X線骶髂關(guān)節(jié)炎。納入疾病對照組（14例類風濕關(guān)節(jié)炎、10例骨關(guān)節(jié)炎和10例痛風）和健康對照（15例），均在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學意義。51例AS患者和20例nr-axSpA患者，男性所占比例分別為78.4%（40例）和45%（9例），平均年齡分別為（35.68±13.62）歲和（30.85±11.22）歲，平均病程分別為（8.78±7.25）年和（4.49±3.01）年，HLA-B27陽性所占比例分別為74.5%（38例）和50%（10例）。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 收集所有患者和健康者外周靜脈血均為清晨空腹抽取，在4℃下處理血液標本，2h內(nèi)盡快分離血清。3000轉(zhuǎn)離心10min，將血清分裝并長期儲存在-80℃冰箱保存，備用。

1.2.2 實驗方法 使用ELISA法檢測所有研究對象血清DKK-1水平，DKK-1試劑盒購自上海源葉生物公司，實驗步驟根據(jù)說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)計量資料采用“±s”表示。結(jié)果滿足正態(tài)分布和方差齊性檢驗，計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗分析，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，計量資料之間相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ax-SpA患者與不同關(guān)節(jié)炎疾病和健康者血清DKK-1表達差異 本研究AS組血清DKK-1水平高于RA組、OA組、Gout組和NC組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而低于nr-axSpA組，差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 ax-SpA患者HLA-B27表達與血清DKK-1水平差異 48例HLA-B27陽性ax-SpA患者和23例HLA-B27陰性患者，HLA-B27陽性患者血清DKK-1水平低于HLA-B27陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎患者與疾病對照組和健康對照組血清±s)

表1 中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎患者與疾病對照組和健康對照組血清±s)

注：與nr-axSpA組比較F=7.146，aP=0.101；與RA組比較F=11.76，aP=0.007；與OA組比較F=3.696，aP=0.009；與Gout組比較F=1.109，aP＜0.0001；與NC組比較F=9.53，aP=0.001

M±SDAS（n=51）nr-axSpA（n=20）RA（n=14）DKK-12133.9±432.9a2303.9±289.41808.7±218.3 M±SDOA(n=10)Gout（n=10）NC（n=15）DKK-11457.3±644.81556.0±357.21718.7±260.4

表2 中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎患者不同HLA-B27表達血清DKK-1水平比較（±s,ng/L）

表2 中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎患者不同HLA-B27表達血清DKK-1水平比較（±s,ng/L）

注：與HLA-B27陰性相比，aP=0.011

實驗室指標例數(shù)DKK-1 HLA-B27陽性482150.47±440.9aHLA-B27陰性232418.8±319.5

2.3 AS患者放射學骶髂關(guān)節(jié)炎與血清DKK-1水平差異 AS患者不同放射學骶髂關(guān)節(jié)炎分級血清DKK-1水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ⅱ級分別與Ⅳ級比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Ⅲ級分別與Ⅱ和Ⅳ級比較差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 強有性脊柱炎患者不同X線骶髂關(guān)節(jié)炎分級血清DKK-1水平比較（ng/L）

2.4 ax-SpA患者血清DKK-1水平與臨床、實驗室及影像學指標相關(guān)性分析 71例ax-SpA患者基線時血清DKK-1水平與臨床指標及炎性指標的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：血清DKK-1水平與病程(r=-0.424，P=0.0001)、BASMI(r=-0.264，P=0.026)呈負相關(guān)；與年齡、BASDAI、脊柱痛、脊柱炎癥、PGA、夜間痛、BASFI、EI、擴胸度、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、ESR和CRP無關(guān)。見表4。

表4 71例中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎患者基線時血清DKK-1水平與臨床指標相關(guān)性分析（ng/L）

基線時血清DKK-1水平與影像學評分相關(guān)分析結(jié)果顯示：20例AS患者血清DKK-1水平與mSASSS評分呈負相關(guān)(r=-0.581，P=0.023)，與42例ax-SpA患者SPARCC評分無關(guān)（r=-0.23，P=0.143）。見圖1。

3 討論

本研究檢測了血清DKK-1水平與ax-SpA患者疾病活動、炎癥反應(yīng)和影像學評分的相關(guān)性。血清DKK-1在AS患者體內(nèi)的表達尚未達成一致結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn)AS患者DKK-1水平高于正常人[6]。而有相反研究發(fā)現(xiàn)AS患者血清DKK-1水平低于健康人，認為低水平DKK-1與新骨形成有關(guān)[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)AS患者與正常人血清DKK-1水平無差異[8]。本研究發(fā)現(xiàn)AS患者DKK-1水平高于健康人，也高于類風濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和痛風患者（P＜0.05），而低于nr-axSpA患者（P＞0.05）。

HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠與蛋白多糖BALB/c小鼠模型對比，兩者均發(fā)生脊椎融合；與雄性DBA小鼠模型對比，兩者先前均無侵蝕之后均發(fā)生外周關(guān)節(jié)強直性病變二者先前均無侵蝕之后均發(fā)生外周關(guān)節(jié)強直性病變[9-10]。HLA-B27可能參與中軸關(guān)節(jié)和外周關(guān)節(jié)強直發(fā)生。研究表明血清DKK-1水平HLA-B27陽性患者比HLA-B27陰性患者是減少的，而BASRI-S和mSASSS評分顯著增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)ax-SpA患者HLA-B27陽性患者血清DKK-1水平低于HLA-B27陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。支持Heba的研究HLA-B27陽性患者可能DKK-1低表達或是AS患者關(guān)節(jié)強直和脊柱骨贅形成的另一個病理生理因素。

圖1 DKK-1與 mSASSS評分相關(guān)性

Diarra[12]在關(guān)節(jié)炎動物模型給予一種DKK-1拮抗劑，與對照組相比，表明阻斷DKK-1骨侵蝕可以完全抑制，但有趣的是發(fā)現(xiàn)有骨贅形成。Uderhardt等[3]使用TNFtg小鼠探索DKK-1在骶髂關(guān)節(jié)炎的作用，給予抗DKK-1單克隆抗體的這些小鼠發(fā)現(xiàn)骨侵蝕減弱而逐漸出現(xiàn)骶髂關(guān)節(jié)融合。免疫組化分析顯示，封鎖DKK-1，骶髂關(guān)節(jié)內(nèi)β-連環(huán)蛋白量高度上調(diào)，提示DKK-1抑制導(dǎo)致Wnt信號增強，隨后出現(xiàn)新骨形成。A國內(nèi)單振興等[13]檢測22例早期AS患者和25例中晚期AS患者血清DKK-1水平，認為中晚期血清DKK-1水平降低于早期患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。骶髂關(guān)節(jié)炎Ⅳ級與Ⅱ級血清DKK-1水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Ⅲ級分別與Ⅱ和Ⅳ級比較差異無統(tǒng)計學意義。認為血清DKK-1表達隨著骨化程度加重呈下降趨勢，可能是AS發(fā)生關(guān)節(jié)強直和骨贅形成的一個重要因素。

Korkosz[14]檢測50例AS患者血清DKK-1水平疾病活動組（BASDAI≥4分）高于低疾病活動組（BASDAI＜4分）和健康對照組，兩組在頸椎和腰椎X線上mSASSS評分無差別，認為AS高度疾病活動可能與新骨形成不相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)aSpA患者血清DKK-1水平與病程、BASMI呈負相關(guān)，與其他指標年齡、BASDAI、脊柱痛、脊柱炎癥、PGA、夜間痛、BASFI、EI、擴胸度和關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)無相關(guān)性。AA炎癥與骨重塑之間的聯(lián)系還未得到充分的解釋。有研究認為AS炎癥與新骨形成之間的關(guān)系，認為二者是疾病獨立的過程[15]。有研究認為基線時的炎癥與骨贅形成有關(guān)，與炎癥持續(xù)存在相比，炎癥已得到控制的病例骨贅形成更常出現(xiàn)于邊緣[16]。Gisela[11]認為Wnt信號通路拮抗劑DKK-1表達與急性時相反應(yīng)物無關(guān)聯(lián)。AS患者在接受TNF-α抑制劑治療，CRP值下降與DKK-1水平變化無相關(guān)性[17]。本研究檢測血清DKK-1水平與炎癥反應(yīng)如ESR、CRP及SPARCC評分無關(guān)，支持炎癥反應(yīng)與骨化形成可能并不緊密相關(guān)的觀點。

有研究認為AS患者血清DKK-1水平與mSASSS評分無相關(guān)性[17]。Heiland等[11]研究65例AS患者，在基線時功能性DKK-1水平在無骨贅形成組高于骨贅形成組，但差異無統(tǒng)計學意義；隨訪了31例無骨贅形成患者2年，無新骨形成的患者DKK-1水平明顯高于有新骨形成的患者，DKK-1與另一個Wnt拮抗劑如硬化蛋白水平呈正相關(guān)，與CRP無關(guān)，但與脊柱放射學評分（mSASSS）呈負相關(guān)。本研究對20例AS患者X線顯示脊柱骨贅形成（mSASSS）評分，發(fā)現(xiàn)DKK-1與mSASSS評分呈負相關(guān)，可以作為評價AS骨化程度潛在生物學標志物之一。

綜上所述，研究認為血清DKK-1在AS患者異常表達，本研究局限于橫斷面研究，仍需擴大樣本長期隨訪研究。并進一步研究確定是DKK-1或是其他Wnt拮抗劑用于預(yù)測新骨形成的進展。另一方面，增強或者恢復(fù)AS患者DKK-1的功能，可能下調(diào)Wnt信號通路，可開發(fā)一種抑制新骨形成的方法，DKK-1在AS的功能作用仍需進一步研究。

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Objective To detect serum levels of DKK-1(Dickkopf-1) in axial spondyloarthropathy (ax-SpA) and correlation analysis. Methods (1) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect 71 cases of patients with initial visiting ax-SpA [including 51 cases of ankylosing spondylitis (AS) and 20 cases of non- radiology axial spondyloarthropathy (nr-axSpA)] and serum levels of DKK-1 in disease control groups (14 cases of RA, 10 patients of OA and 10 cases of gout patients) and 15 cases of healthy control group; (2)According to the expression of HLA-B27,ax-SpA patients were divided into positive group (48 cases) and negative group (23 cases);accordance with the revised New York radiological sacroiliitis grading standards,ax-SpA patients were divided into grade Ⅱ (16 cases), grade Ⅲ (12 cases) and grade Ⅳ (23 cases), comparing to expression differences of serum DKK-1 in different groups; (3)Correlation analysis serum levels of DKK-1 with ax-SpA patients clinical indicators,inflammatory markers and radiographic score. Results (1)Serum levels of DKK-1 in AS patients [(2133.9±432.9)ng/L] higher than disease control groups (including RA, OA and Gout patients) and healthy control group [(1718.7±260.4)ng/L],it has a statistical significance (P＜0.05). But lower than nraxSpA patients [(2303.9±289.4)ng/L], the difference was not statistically significant. (2)Serum DKK-1 levels in ax-SpA patients with HLA-B27 positive below HLA-B27 negative patients [(2150.47±440.9)ng/L], the difference had a statistically significant (P＜0.05). Serum levels of DKK-1 in radiographic sacroiliitis grade Ⅳ patients [(1878.91±285)ng/L] and grade Ⅲ patients [(2059.33±324.26)ng/L], the difference had a statistically significant (P＜0.05), whereas serum levels of DKK-1 with grade Ⅱ [(2248.18±365.53)ng/L] and Ⅲ grade [(2248.18±365.53)ng/L], grade Ⅲ and grade Ⅳ, differences was no statistically significant. (3)Serum levels of DKK-1 with duration (r=-0.424 P=0.0001), BASMI (r=-0.264,P=-0.026) of ax-SpA patients and mSASSS score of AS patients (r=-0.581,P=0.023) were negatively correlated, Serum levels of DKK-1 with ax-SpA patients in clinical indicators,inflammatory markers and SPARCC score was no correlation. Conclusion With the severity of progressive ossification, DKK-1 level downward trend that may be an important factor in the occurrence of ankylosis and osteophyte formation of AS; DKK-1 level as one of potential biological markers that can be evaluated ossification degree of AS.

Ankylosing spondylitis; Axial spondyloarthropathy; Dickkopf-1; Sacroiliitis joint X-ray; MRI

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.5.003

山西 030001 山西醫(yī)科大學 （崔銀風） 山西醫(yī)學科學院 山西大醫(yī)院風濕免疫科 （張莉蕓 張改連 許珂 馬丹） 山西大醫(yī)院放射科 （郭東強） 山西大醫(yī)院磁共振室（閆俊榮）

張莉蕓 E-mail:zhangly2006@sina.com