章瓊　蔣高中　李冰

摘要：氨氮脅迫是影響水產養(yǎng)殖和生態(tài)環(huán)境的重要非生物脅迫之一；而轉錄組學是一個新興的研究細胞表型和功能的重要手段，在研究基因結構、表達和功能上開拓了一個新型的研究方向。簡述了水產養(yǎng)殖中氨氮的危害以及氨氮脅迫而引起的生理和生化反應，同時介紹了常見的轉錄組學平臺技術及其在一些脅迫反應代謝調控機制及分子機制研究中的應用，認為水產動物氨氮脅迫的轉錄組分析將為水產動物的毒理學效應提供重要的理論依據和線索，也將在水產動物分子育種中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：水產動物；氨氮脅迫；代謝調控機制；轉錄組；轉錄組測序

中圖分類號： S917.4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0227-04

氨氮是水產養(yǎng)殖中常見的脅迫因子，以2種形式存在于水體中，即非離子氨（NH3）和離子銨（NH+4），離子銨的存在對水產動物是無毒的，對水產動物產生危害的是非離子氨，主要影響它們的游泳行為、生長性能、呼吸及代謝的變化、滲透調節(jié)、免疫力等。

隨著轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等的出現，標志著生命科學的研究已經跨入后基因組時代。轉錄組（transcriptome）概念最先是由Velcalescu和Kinzler等在1997年提出的，是指某一特定生物體在特定狀態(tài)下所有基因轉錄產物的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA，其中 mRNA 較為引人關注，被研究得較多，因此狹義上的轉錄組一般指的是所有mRNA的總和。

目前，人們已經對機體受氨氮脅迫時的生理和生化反應做了大量深入的研究，然而對引起這些反應的代謝調控機制、分子機制的相關研究報道甚少。本文主要通過綜述氨氮脅迫的危害及生理生化反應，以及轉錄組平臺技術的應用，以期為氨氮脅迫的代謝調控機制提供線索，并對其分子機制的研究提出展望。

1 水產養(yǎng)殖中氨氮的來源及其危害

1.1 氮素的循環(huán)及水體中氨氮的來源

自然界中的各種元素都是守恒的，都可以循環(huán)利用，在水體中也是如此，而影響水產養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展最大的因素是氮元素的循環(huán)。天然水體中溶解的有機氮主要來自動物分泌物、動植物尸體以及人類的排放等，這些有機氮首先在微生物的作用下分解為氨（NH3），如果水體中溶氧充足，總氨會迅速在亞硝化細菌和硝化細菌的聯合作用下氧化為NO-3；而在溶氧偏低的水體中，由于反硝化細菌的大量繁殖，不僅使總氨無法進一步氧化，而且使原有的亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮被還原為總氨，總氨也被進一步還原為氮，從而溢出水面。氮元素在自然界的循環(huán)過程如圖1[1]所示。

在養(yǎng)殖水體中，氨氮的來源主要有以下幾個方面：（1）動物糞便殘餌等有機物經過異養(yǎng)細菌的氨化作用產生；（2）養(yǎng)殖生物自身的轉氨和脫氨作用產生；（3）人類活動如農藥、肥料的過度利用，工業(yè)廢水等含氮化學試劑的排放；其中前2個方面是氨氮的主要來源。

1.2 水產養(yǎng)殖中的氨氮危害

氨氮是養(yǎng)殖水體中最重要的污染物之一，非離子氨進入水產動物體內后，可以直接影響魚類的鰓組織，對機體酶水解反應以及細胞膜穩(wěn)定性產生明顯的影響，表現出不攝食、呼吸困難、抵抗力減弱、驚厥、昏迷等現象，嚴重時可導致水產動物大批死亡，造成嚴重的經濟損失[2-3]。

2 水產動物對氨氮脅迫的生理和生化響應研究進展

2.1 水產動物受氨氮脅迫的癥狀

Wicks等研究表明，外界環(huán)境中高濃度氨氮引起的血氨積累會影響魚的游泳功能，使其表現出急躁不安、游動遲緩等癥狀，并在對褐鱒（Salmo trutta）、虹鱒（Salmo gairdneri）、大馬哈魚（Oncorhynchus keta）的研究中發(fā)現，血氨濃度與最大游泳速度呈負線性關系[4]。在氨氮（0.05～2.50 mg/L）脅迫24 h內，凡納濱對蝦血細胞數量明顯減少，抗菌溶菌活力顯著變弱，血清酚氧化酶活力明顯升高[5]。在高濃度氨氮作用下，魚鰓的結構會發(fā)生改變，表現為鰓小片加厚、上皮細胞和黏液細胞增生，動脈血管內2層上皮細胞間的淋巴腺增多；此外鰓結構的改變還會引起生理功能的改變，影響魚類氣體的交換效率[6]。養(yǎng)殖水體中氨氮含量過高除了會影響鰓組織外，還會導致肝組織變松軟、易碎、充血阻塞等，有的甚至出現空泡狀或者壞死腔[7-8]。王金葉等研究發(fā)現，在氨氮或亞硝酸鹽脅迫作用下，會導致鯉魚紅細胞膜上的過氧化脂質含量增加，從而使得紅細胞膜通透性、滲透脆性增高、流動性降低、變形性變差[9]；此外氨氮還會對紅細胞的胞核造成傷害，如泥鰍在氨氮含量超標水質中的紅細胞微核率較高[10]。即便是低濃度的氨氮，長期接觸也會損傷鰓組織，會出現鰓小片彎曲、粘連或融合的現象[11]。

2.2 水產動物氨氮脅迫中毒機理

水體中的氨氮達到一定濃度后，非離子氨很容易通過細胞膜進入水產動物體內，使得血液中的氨氮濃度升高，血液pH值隨之上調，從而導致水產動物體內多種酶的活性受到抑制，降低了血液的攜氧能力，超出水產動物的自我調節(jié)能力即可導致缺氧，表現中毒癥狀。氨氮主要是侵襲黏膜，特別是鰓表皮黏膜和腸黏膜，其次是神經系統(tǒng)，同時可使水產動物的肝腎系統(tǒng)遭到破壞，引起體表及內臟充血，嚴重時可導致昏迷甚至死亡。比較認可的關于氨氮對水產動物危害機理的解釋是認為高濃度的氨氮會取代生物體內的鉀離子，引起N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體結合活性的降低，導致中樞神經系統(tǒng)中流入過量的鈣離子并引起細胞死亡[12]，具體的毒理機制還有待研究。

2.3 水產動物氨氮脅迫下對自身免疫功能的影響

在氨氮脅迫的情況下，魚類機體的代謝被打亂，體內的抗氧化防御性功能酶被激活，從而使機體的免疫功能受到影響。迄今為止，已有較多關于氨氮對水產動物毒理與免疫功能影響的研究，研究得較為透徹的主要是蝦蟹類的氨氮脅迫。研究表明，蝦蟹類在氨氮脅迫作用下，其體內與免疫相關酶如酚氧化酶（PO）、血清酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LSZ）、血清超氧化物歧化酶（SOD）等活性明顯變化，同時對病原體的易感性提高[13-17]；并且隨著脅迫時間的延長，魚類體質明顯下降，死亡率明顯增加[18]，蝦蟹體內抗氧化酶系統(tǒng)和細胞膜的穩(wěn)定性也會受到嚴重影響，進而破壞其滲透平衡[19]。在斑馬魚的氨氮試驗中[20]，ATP酶變化的總趨勢是受氨氮抑制的，并且隨氨氮濃度的增加，ATP酶受抑制的程度也增加，可能是由于隨著氨氮質量濃度增加，使鰓部損傷，打破體內離子平衡而加大補償性滲透調節(jié)影響所致。endprint

3 轉錄組分析研究進展

相對于基因組而言，轉錄組更具有時間性和空間性，轉錄組反映的是特定條件下活躍表達的基因。轉錄組分析的主要目標是：對所有的轉錄產物進行分類，檢測新的轉錄本，包括未知轉錄本和稀有轉錄本；確定基因的轉錄結構，如起始位點、轉錄后修飾，以及非編碼區(qū)功能研究等；量化各轉錄本在發(fā)育過程中以及在不同生理或病理條件下表達水平的變化；轉錄本結構變異的研究以及開發(fā)新的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）等[21-22]。

3.1 轉錄組研究的基本方法

研究轉錄組的方法主要有2大類：（1）基于雜交技術的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片；（2）基于測序技術的SAGE（serial analysis of gene expression）、MPSS（massively parallel signature sequencing）、全長cDNA文庫和EST文庫的測序分析。對3種主要的轉錄組研究方法的比較見表1。

現在通常將基于第2代測序技術的轉錄組測序分析稱為RNA-Seq。由表1可以明顯看出，RNA-Seq具有以下幾點優(yōu)勢：（1）通量高，能達到覆蓋整個基因組、轉錄組的要求；（2）靈敏度、分辨率很高，可以精確到少至幾個拷貝的稀有轉錄本，同時不存在傳統(tǒng)熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音的影響；（3）測序時間和成本顯著下降；（4）不受限制性，可以對任意物種進行全轉錄組分析，同時能檢測未知基因，發(fā)現新的轉錄本。

3.2 RNA-Seq常用的測序平臺及原理

RNA測序技術沿用了SAGE技術和MPSS技術的基本原理，該技術首先將細胞中的所有轉錄產物反轉錄為cDNA 文庫，然后將 cDNA文庫中的DNA 隨機剪切為小片段，利用新一代高通量測序儀測序直到獲得足夠的序列，然后計算這些短序列的個數并分析其在整個基因組中的分布，可以計算出細胞的轉錄組表達水平[22]。高通量測序避免了在亞克隆過程中引入的偏差，且獲得的短序列長度增加了，從而提高了識別其對應基因的準確性。目前常用的高通量測序技術，主要是Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術、ABI公司的SOLiD技術以及Helicos Biosciences公司的單分子測序（single molecule sequencing，SMS）技術4種。各平臺測序原理、長度的不同決定了其不同的應用側重，我們要在熟悉各種高通量測序技術特點的基礎上進行正確的選擇，常見的4種RNA-Seq測序平臺的比較見表2[23]。

3.3 RNA-Seq測序后結合生物信息學的相關應用

大量研究表明，RNA-Seq測序后，可選擇已經公布的相同或者相近物種的基因組和基因信息為參考，進行基因的結構優(yōu)化分析，預測新的基因，差異表達基因分析，基因功能注釋，可變剪切分析以及SNPs、SSR分析等等[24]。當沒有參考基因組時，則以GenBank中已公布的有關數據為參考，將測序數據經過軟件拼接從頭組裝，獲得contigs（重疊群）和unigenes（拼接的非冗余基因），然后再進行之后的分析。拼接組裝之后就可以進行unigene功能注釋，與數據庫中已注釋功能的基因對比進行GO（gene ontology，基因的分子功能、生物學過程和細胞組件）和KEGG（kyotoencyclopedia of genes and genomes，基因和基因產物、基因編碼產物、新陳代謝途徑等）分析；開發(fā)品種的SNP和SSR，從而為品種發(fā)育及疾病的判斷提供支持；比較不同樣品間表達差異基因，進行基因差異表達分析，得出每個樣品中的上調或者下調基因等[24]。

4 轉錄組分析在動植物研究中的應用

4.1 轉錄組分析在植物抗逆性研究中的應用

嚴東輝通過半干旱地區(qū)的胡楊對干旱適應性響應的轉錄組分析，獲得了277個在干旱處理中表現出一致變化的基因，有1 938個表達轉錄子表現出干旱強度的?；?，并說明了不同干旱程度激活相應的響應調解途徑[25]；霍達等整合分析了7種不同鹽生植物鹽脅迫應答轉錄組學的研究結果，從整體上分析了植物在鹽脅迫應答過程中所有mRNA的變化情況，建立了鹽堿脅迫相關的cDNA文庫和EST數據庫[26]，并利用反向Northern雜交分析技術[27-28]、5′cDNA末端快速擴增（RACE）技術[28]、反轉錄PCR[29-30]、實時定量反轉錄PCR等輔助技術對脅迫相關基因進行了功能分析[31]，為全面理解鹽生植物應答鹽堿脅迫的代謝調控機制提供了線索；許長征通過低磷處理玉米根系的轉錄組分析，揭示了低磷脅迫對玉米轉錄的影響[32]，對挖掘作物磷高效分子育種有重要意義。

4.2 轉錄組分析在水產動物分子生物學研究中的應用

曾地剛等通過高通量測序，獲得了豐富的凡納濱對蝦轉錄組信息，為其新基因的克隆和基因組學研究提供了有價值的數據[33]；在感病草魚脾臟的比較轉錄組分析試驗中，通過轉錄組技術篩選出了與抗病草魚出血病病毒相關的信號因子及信號通路[34]；董迎輝通過高通量454測序技術對泥蚶不同組織器官和不同發(fā)育階段樣品進行轉錄組測序，并進行拼接組裝和基因注釋，發(fā)掘與生長、代謝、繁殖抗病等主要經濟性狀相關的基因，為后續(xù)開展功能基因研究和分子育種等提供了有價值的信息[35]。

5 結論

迄今為止，已有100多篇關于植物在鹽脅迫或者干旱脅迫下的轉錄組學的研究報道[36]，關于水產動物疾病等的轉錄組分析也有少量報道，但是關于水產動物氨氮脅迫轉錄組分析的研究報道甚少，可以以已發(fā)表的動植物相關脅迫轉錄組分析為借鑒和線索來開展轉錄組分析在水產動物氨氮脅迫中的應用研究?！爸袊茖W技術協(xié)會第264次青年科學家論壇水產動物育種與生物技術的會議”中曾提到，高通量測序等遺傳工具的開發(fā)、尼羅羅非魚性腺發(fā)育轉錄組分析、高通量測序的SNP篩選及基因克隆等在水產動物育種中轉錄組應用的研究有越來越多的趨勢。endprint

氨氮脅迫的分子機制的研究依賴于技術的進步，新興的RNA測序技術能產生海量的數據，RNA-Seq是基于直接測序的方法[22]，以定量的方式對全轉錄組進行深度測序，將給水產動物氨氮脅迫的研究帶來新的契機。此外，逆境脅迫下的水產動物轉錄組學與蛋白組學以及代謝組學的研究結果相結合將推動抗逆分子機制的研究。

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