李清+李標(biāo)++郭順星

[摘要]SSR是應(yīng)用于金釵石斛鑒定和遺傳多樣性研究的重要分子標(biāo)記之一。為開發(fā)新的SSR標(biāo)記，尋求快速鑒別金釵石斛的方法，該文通過生物信息學(xué)手段對(duì)金釵石斛轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索、分析，并設(shè)計(jì)出SSR特異性引物。結(jié)果顯示，從金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中搜索到32 709個(gè)SSR，分布與26 742條unigenes中，SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率為1290%，平均每 3 748 bp含1個(gè)SSR 位點(diǎn)。其中，單核苷酸是最主要重復(fù)類型，占SSR總數(shù)的7218%，其次是二核苷酸和三核苷酸，分別占SSR總數(shù)的1597%，1119%。而在所有重復(fù)基元中，A/T出現(xiàn)頻率最高，AG/CT次之。通過設(shè)計(jì)、篩選，該研究共獲得 62 157對(duì)SSR位點(diǎn)特異性引物。從中隨機(jī)挑選20對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，17對(duì)擴(kuò)增出清晰、可重復(fù)的條帶，擴(kuò)增率為850%。選擇3種石斛檢測(cè)引物多態(tài)性，共獲得多態(tài)性引物13條。以上結(jié)果表明，金釵石斛轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的unigenes信息可作為開發(fā)SSR標(biāo)記的有效來源，其中的SSR位點(diǎn)出現(xiàn)密度大、類型豐富、多態(tài)性潛能高，在金釵石斛及其近緣種的分子鑒定、遺傳多樣性與分子育種等方面具有較好的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]金釵石斛； 轉(zhuǎn)錄組； SSR； 位點(diǎn)信息

又名金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草等，為蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium Sw多年生附生草本植物，也是歷史上記載最早的石斛習(xí)用種類[1]。其新鮮或干燥莖入藥具有益胃生津、滋陰清熱等功效，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，并作為藥用石斛最重要的基原藥材被收錄于歷代《中國藥典》。金釵石斛是傳統(tǒng)中成藥石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛清胃散以及現(xiàn)代中成藥脈絡(luò)寧注射液、復(fù)方“清咽寧”等的重要配伍成分，具有巨大的市場(chǎng)需求和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛還具有改善記憶、抗氧化、抗腫瘤等重要功效，藥用開發(fā)前景不可估量[24]。

然而，由于長期的過度開采和生境破壞，金釵石斛野生資源遭到嚴(yán)重的破壞，幾近枯竭。日漸突出的供需矛盾，使市面上金釵石斛混淆品的泛濫現(xiàn)象不斷加劇。據(jù)報(bào)道，市場(chǎng)上常有將蘭科石豆蘭屬、金石斛屬和石仙桃屬等數(shù)十種植物作為藥用石斛混入商品流通的現(xiàn)象[5]。以非適產(chǎn)地的劣質(zhì)石斛充當(dāng)優(yōu)質(zhì)金釵石斛的現(xiàn)象屢見不鮮。而對(duì)于大部分人工栽培的金釵石斛，其確切的種源地?zé)o法考證、遺傳背景認(rèn)識(shí)不清等問題更是久存不解。如此種種，嚴(yán)重影響了金釵石斛的藥效質(zhì)量和開發(fā)利用，尋找高效、便捷的鑒別方法迫在眉睫。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記逐步應(yīng)用于金釵石斛藥材鑒別和種質(zhì)資源研究中，其中SSR（simple sequence repeats，簡單重復(fù)序列）標(biāo)記憑借其多態(tài)性高、可重復(fù)性強(qiáng)、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，成為金釵石斛重要的分子標(biāo)記之一[6]。然而，由于傳統(tǒng)的SSR標(biāo)記開發(fā)過程繁瑣、工作量大，費(fèi)用高，現(xiàn)階段針對(duì)金釵石斛的SSR系統(tǒng)研究還比較少，已開發(fā)的金釵石斛SSR 標(biāo)記也僅198對(duì)，難以滿足研究的需求。所幸的是，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中大規(guī)模開發(fā)SSR標(biāo)記成為可能。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于地黃[7]、莢膜黃芪[8]等藥用植物的SSR標(biāo)記開發(fā)過程中?；诖?，本文將首次對(duì)金釵石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析其分布、組成特征，并初步評(píng)價(jià)其可用性，設(shè)計(jì)SSR引物，旨在豐富金釵石斛的分子標(biāo)記庫，為金釵石斛的分子鑒定、遺傳多樣性研究及分子育種提供有效的工具。

1材料與方法

11金釵石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本來源于貴州赤水的金釵石斛組培苗，提取莖RNA后送北京諾禾致源生物信息科技有限公司，利用Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，最終獲得207 283條unigenes。

12金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR的篩選使用MISA （http：//pgrc ipkgatersleben de/misa/Misa html） 對(duì)金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索和定位。搜索的標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)至少10次，二核苷酸至少重復(fù)6次，三至六核苷酸至少重復(fù)5次；同時(shí)篩選被間隔小于或等于100 bp堿基打斷的復(fù)合型 SSR。

13金釵石斛SSR引物設(shè)計(jì)調(diào)用 Primer 30引物批量設(shè)計(jì)程序?qū)?SSR位點(diǎn)的兩端序列設(shè)計(jì)引物，每條SSR序列產(chǎn)生3條引物。主要的引物參數(shù)設(shè)置為：退火溫度（Tm）在57～63 ℃，上、下游引物的Tm相差不大于5 ℃；擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100～280 bp；引物長度 在18～27 bp；GC量在40%～65%。將設(shè)計(jì)出的引物通過以下方式篩選：引物不能存在SSR；將獲得的引物比對(duì)到unigene序列，引物的5′端允許有3個(gè)堿基的錯(cuò)配，3′端允許有1個(gè)堿基的錯(cuò)配；去掉比對(duì)到不同unigenes上的引物，篩選唯一匹配的引物；使用SSRFinder校驗(yàn)SSR，使用產(chǎn)物序列來尋找SSR，檢驗(yàn)結(jié)果是否與MISA 結(jié)果相同，并篩選出相同的SSR產(chǎn)物。

14金釵石斛SSR引物PCR擴(kuò)增隨機(jī)選擇合成20對(duì)引物（蘇州金唯智生物科技有限公司），并提取金釵石斛、鐵皮石斛、霍山石斛葉片DNA（北京艾德萊生物科技有限公司，CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendof Mastercycle 梯度PCR儀上進(jìn)行。

25 μL的PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：Taq PCR Master Mix （2×）125 μL，10 μmol·L-1上下引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性1 min，最佳Tm退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

21金釵石斛SSR數(shù)量與分布對(duì)金釵石斛轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的207 283條unigenes進(jìn)行檢索，共在26 742條unigenes中找到符合條件的32 709個(gè)SSR。SSR發(fā)生頻率（含有SSR的unigenes數(shù)目與總unigenes數(shù)目之比）為1290%，出現(xiàn)頻率（檢出SSR個(gè)數(shù)與總unigenes數(shù)目之比）為1578%。其中28 061條unigenes含單個(gè)SSR 位點(diǎn)，4 648條unigenes含2個(gè)及2個(gè)以上SSR 位點(diǎn)。復(fù)合型SSR數(shù)目為1 572個(gè)。

金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中，SSR 的主要重復(fù)類型是單核苷酸，占SSR總數(shù)的7218%，二核苷酸和三核苷酸次之，分別為1597%，1119%，四、五、六核苷酸重復(fù)的數(shù)量極少，總計(jì)067%。從分布情況看，金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中平均每3 748 bp 就含有1個(gè)SSR位點(diǎn)。但不同重復(fù)基序長度SSR分布的平均距離差距很大，其中單核苷酸重復(fù)最多，分布平均距離519 kb/SSR，五核苷酸重復(fù)最少，每條SSR分布平均距離7 66306 kb （表1）。

李清等：金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息分析表1金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR不同重復(fù)基元分布情況

金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中共搜索到189種不同基序序列類型的SSR，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)分別有4，12，60，77，16，20種類型。從出現(xiàn)頻率來看（圖2），占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的重復(fù)基元類型是單核苷酸A/T，為總SSR 數(shù)目的7068%，其次是AG/CT和AT/AT，分別占總SSR數(shù)目的1104%，343%。在三核苷酸重復(fù)基元中以AAG/CTT數(shù)目最多，占總SSR 數(shù)目252%。其他四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)基元類型分布較少，出現(xiàn)頻率較低。

金釵石斛轉(zhuǎn)錄組被分為3個(gè)區(qū)域，分別是5′非編碼區(qū)、3′非編碼區(qū)和蛋白編碼區(qū)（表2）。其中非編碼區(qū)域的SSR數(shù)目最多，為編碼區(qū)SSR位點(diǎn)數(shù)目的1689倍。這一結(jié)果與之前的研究，認(rèn)為編碼區(qū)對(duì)移碼突變的選擇性會(huì)限制SSR的擴(kuò)張的結(jié)論相一致[9]。從理論上分析，來自非編碼區(qū)域的SSR面臨的選擇壓力較與來自編碼區(qū)域的要小，具有比較高的多態(tài)潛能。在本研究中，5′和3′非編碼區(qū)的SSR位點(diǎn)數(shù)目都顯著高于編碼區(qū)序列，預(yù)示著金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性潛能。

對(duì)金釵石斛轉(zhuǎn)錄SSR位點(diǎn)在非編碼區(qū)和編碼區(qū)的分布情況進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，三核苷酸的整倍體，例如三核苷酸SSR和六核苷酸SSR，其出現(xiàn)在編碼區(qū)域的概率更大，分別占已確定分布位置的該類型SSR數(shù)目的3690%，50%，遠(yuǎn)高于單核苷酸的327%及五、六核苷酸的0%。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是三核苷酸重復(fù)產(chǎn)生的是非編碼突變，其導(dǎo)致的危害相對(duì)較小。但在編碼區(qū)域內(nèi)，增加或減少非整倍體三核苷酸往往會(huì)導(dǎo)致編碼框移碼和面臨較大的選擇壓力[10]。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)AT富含基元比較容易出現(xiàn)在3′非編碼區(qū)，例如6463%的已知A，7222%的已知AT和7407%的AAT落入3′非編碼區(qū)。這很可能與AT富含基元在3′非編碼區(qū)作為一些順式元件出現(xiàn)相關(guān)，例如多聚腺苷酸（polyA）結(jié)尾信號(hào)的AAUAAA，其關(guān)系到mRNA的穩(wěn)定[11]。

22金釵石斛SSR的可用性評(píng)價(jià)SSR分子標(biāo)記多態(tài)性是評(píng)判其可用性的重要依據(jù)。SSR長度是影響其多態(tài)性高低的重要因素，當(dāng)SSR長度大于或等于20 bp 時(shí)多態(tài)性較高，長度在12 ～ 20 bp 的SSR 多態(tài)性中等，而長度在12 bp以下時(shí)多態(tài)性極低[12]。本研究中，具中等多樣性（長度在12 ～ 20 bp）的SSR有14 718條，占SSR總數(shù)的4500%；具較高多樣性（長度大于或等于20 bp）的SSR有2 842條，占SSR總數(shù)的869%。換言之，超50% 的SSR位點(diǎn)具有中等水平以上的多樣性。此外，低級(jí)基序SSR往往比高級(jí)基序SSR更容易滑動(dòng)而產(chǎn)生多態(tài)性[13]。而本研究中20 bp 以上的低級(jí)重復(fù)基元（單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸）較多，共1 181條，占20 bp以上SSR總數(shù)的4156%。由此可預(yù)見金釵石斛轉(zhuǎn)錄組來源的SSR 具有較高的多態(tài)性潛能，在分子標(biāo)記研究方面具有較高的利用價(jià)值。

23金釵石斛SSR引物設(shè)計(jì)為更好的應(yīng)用金釵石斛SSR位點(diǎn)，本研究應(yīng)用Primer 30軟件對(duì)上下游序列均不小于150 bp的SSR 設(shè)計(jì)引物，每條序列產(chǎn)生3對(duì)引物。經(jīng)SSRFinder校驗(yàn)和除去不符合條件的引物后，共為20 719條SSR序列設(shè)計(jì)出62 157對(duì)SSR位點(diǎn)特異引物，占到金釵石斛SSR總數(shù)的6334%。其中針對(duì)20 bp以上且包含低級(jí)基序（單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復(fù)）的SSR序列共設(shè)計(jì)出552對(duì)引物。

24金釵石斛SSR引物評(píng)價(jià)分析為檢測(cè)新發(fā)掘的金釵石斛SSR位點(diǎn)特異引物的可靠性，隨機(jī)挑選20對(duì)不同重復(fù)單元（一、二、三、四、五、六核苷酸）的引物對(duì)金釵石斛DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表3），結(jié)果顯示，17對(duì)引物在金釵石斛中成功擴(kuò)增，引物擴(kuò)增率為850%。其中12對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小吻合，5對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度超過預(yù)期（圖3A），說明本研究所設(shè)計(jì)的大部分引物真實(shí)可靠。

與此同時(shí)，利用該20對(duì)引物對(duì)金釵石斛近緣種鐵皮石斛和霍山石斛的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果證明金釵石斛SSR引物在石斛種間的通用性良好，17對(duì)在金釵石斛中成功擴(kuò)增的引物在鐵皮石斛和霍山石斛表3金釵石斛SSR引物序列

而通過比較3種石斛DNA的擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3A，B，C），20對(duì)引物中，13對(duì)引物呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)比率達(dá)650%。13對(duì)多態(tài)性引物共得到39個(gè)擴(kuò)增片段，其中多態(tài)性片段32個(gè)，每對(duì)引物平均產(chǎn)生246個(gè)多態(tài)性片段，可見SSR引物具有較高的多態(tài)性，具有足夠的潛力在石斛鑒定、居群間多樣性評(píng)價(jià)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究上得到應(yīng)用。

3討論

本研究大規(guī)模地從金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中檢測(cè)出32 709個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于26 742條unigenes中。由于目前對(duì)SSR的定義沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，采用的分析方法和最小長度定義的不同，使獲得的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量也存在較大的差異。選擇分析方法相近的轉(zhuǎn)錄組SSR進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率為1578%，顯著高于云南松（307%）[14]、茯苓（532%）[15]、燈盞花（699%）[16]，而與金線蓮（1222%）[17]，建蘭（1754%）[18]相差不大。這說明金釵石斛轉(zhuǎn)錄組具有豐富的SSR位點(diǎn)，可為SSR的開發(fā)提供重要的資源庫。同時(shí)也可以看出親緣關(guān)系近的物種間SSR豐度更為相近。而對(duì)金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)類型分析發(fā)現(xiàn)，短重復(fù)單元（單核苷酸至三核苷酸）的數(shù)量要比長的重復(fù)單元數(shù)量要多，與大多數(shù)物種中的分布情況一致，支持了長的重復(fù)單元的SSR具有較高可變性的觀點(diǎn)。

SSR的多樣性與不同基序序列類型存在一定關(guān)系，如由于打破AT鍵所需的能量低于GC堿，AT的波動(dòng)較GC容易，SSR的基序類型中存在A/T優(yōu)勢(shì)[19]。在本研究中，從不同核苷酸類型的堿基組成分析可知，金釵石斛轉(zhuǎn)錄SSR中A/T，AAAT/ATTT分別是單核苷酸、四核苷酸的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，AT/AT及AAT/ATT的數(shù)目分別在二核苷酸和三核苷酸中排名第二和第三，表現(xiàn)出了明顯的A/T優(yōu)勢(shì)。相反G/C在基序中的出現(xiàn)頻率很低，C/G和CG/CG在單核苷酸和二核苷酸中所占的比例均小于220%。這很好的驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。但也有觀點(diǎn)認(rèn)為A/T優(yōu)勢(shì)的出現(xiàn)是由于甲基化的C殘基轉(zhuǎn)化為T及位于3′末端的polyA序列插入基因組后形成富含A的原始SSR序列所致[2021]，具體原因有待進(jìn)一步考究。

Weber等[22]將SSR分為3類，分別是完全由單一的核苷酸重復(fù)組成的完美型，由單一重復(fù)基元組

M50 bp Maker ZM201（從上至下依次為400，350，300，250，200，150，100，50 bp）；A金釵石斛；B鐵皮石斛；C霍山石斛。

成，但中間被少量非重復(fù)基元核苷酸隔開的非完美型，以及由2種或2種以上重復(fù)基元組成的復(fù)合型。分型研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)以完美型為主，占總SSR位點(diǎn)數(shù)目的9519%。由于非完善型和復(fù)合型SSR常常代表著序列之間存在較多的插入、缺失、堿基置換等基因突變，可以推測(cè)金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)具有較高的可靠性，在遺傳分析方面具有較大的潛力。

SSR位點(diǎn)的可靠性還體現(xiàn)在其較高的有效擴(kuò)增率和多態(tài)性。在本研究中，除少量可能是由于所設(shè)計(jì)的引物序列位于2個(gè)外顯子上，或者基因組對(duì)應(yīng)的序列含有內(nèi)含子而不具備SSR序列特征等原因[23]造成的擴(kuò)增失敗外，所有候選引物均獲得有效擴(kuò)增，擴(kuò)增率為850%，屬于較高的擴(kuò)增水平。而通過比較引物在金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛3種不同石斛中擴(kuò)增情況，可發(fā)現(xiàn)13對(duì)引物呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)比率為650%。值得注意的是，本研究僅采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)SSR的多態(tài)性進(jìn)行初步的分析，如采用高分辨率的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，呈現(xiàn)多態(tài)性引物的比例將會(huì)更高，由此可見SSR的多態(tài)性相當(dāng)豐富，對(duì)石斛具有良好的鑒別能力，可作為品種資源鑒定的一個(gè)輔助工具。

SSR除了作為一種分子標(biāo)記外，還具有功能上的意義，包括它在染色體組織上的影響，對(duì)基因活性、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期和糾錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等等[2425]。通常，可以根據(jù)SSR所在位置初步判斷它的功能，分布在5′非編碼區(qū)的SSR可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，分布在3′非編碼區(qū)的SSR可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄滑移[26]。在金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中，分布在5′和3′非編碼區(qū)的SSR數(shù)量豐富，分別是2 131，3 357個(gè)。它們其中的部分可能對(duì)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)活性起到一定的作用，對(duì)其進(jìn)一步的深入研究，使無功能分子標(biāo)記向可揭示基因轉(zhuǎn)錄功能的分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化，將有利于金釵石斛功能基因資源的定位和開發(fā)利用。

總體而言，金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR不但出現(xiàn)頻率高，且類型豐富，具有較高的多態(tài)性潛能和可用性?；谵D(zhuǎn)錄組的SSR分子標(biāo)記開發(fā)充分利用了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，不僅保留了基因內(nèi)部SSR的特異性和高保守性的優(yōu)點(diǎn)，大大降低了開發(fā)成本，還避免了基因組SSR周期長、操作繁瑣，以及ESTSSR的數(shù)據(jù)量少的缺點(diǎn)，為進(jìn)一步豐富的金釵石斛SSR標(biāo)記奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為金釵石斛的遺傳資源評(píng)價(jià)、種質(zhì)資源改良、物種鑒定等提供了重要的參考依據(jù)。

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