付瑞敏 楊雪 谷亞楠 薛婷婷 邢文會(huì) 張紅 張麗琴 ?；燮? 陳五嶺

摘要：為了了解長(zhǎng)慶油田石油烴降解菌產(chǎn)生物表面活性劑的情況，對(duì)菌株CQ6以原油為碳源時(shí)石油的降解率和發(fā)酵液表面張力進(jìn)行了研究，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)該菌產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在單因素的基礎(chǔ)上，選擇溫度、轉(zhuǎn)速和初始加油量3個(gè)因素，利用Box-Behnken中心組合原理和響應(yīng)面分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了回歸分析，得到了石油烴降解菌CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明，菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的最佳條件為溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速190 r/min、接種量3.4%。在此條件下，菌株CQ6對(duì)石油的降解率可由優(yōu)化前的64.4%升高至80.2%，菌株發(fā)酵液的表面張力由優(yōu)化前的32.5 mN/m降至27.0 mN/m。

關(guān)鍵詞：石油烴降解菌；生物表面活性劑；發(fā)酵；響應(yīng)面分析；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2710-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.040

Optimization of Conditions for Petroleum-degrading Bacteria CQ6

Producing Biosurfactant

FU Rui-min1，2，YANG Xue1，GU Ya-nan2，XUE Ting-ting2，XING Wen-hui1，ZHANG Hong1，ZHANG Li-qin1， CHANG Hui-ping1，CHEN Wu-ling2

（1.Department of Life Science，Henan Institute of Education，Zhengzhou 450046，China；

2.College of Life Science，Northwest University，Xian 710069，China）

Abstract： In order to determine the surfactant-producing situation of petroleum-degradation bacteria in Changqing oil field， degradation rate of petroleum and surface tension of fermentation broth were studied when stain CQ-6 used crude oil as the carbon source， and the fermentation condition was optimized. Based on the single factor experiment， the temperature， the rotate speed and initial amount of oil as factors， the prediction model of quadratic regression polynomial equation on surfactant-producing was simulated with Box-Benhnken central composite principle and response surface methodology. The result showed that，the optimum condition of biosurfactant producing by strain CQ6 was as follows： the temperature was 25 ℃，the rotate speed was 190 r/min and the initial amount of oil was 3.4%.Under this condition， the degradation rate of petroleum increased from 64.4% to 80.2% and the surface tension of fermentation broth decreased from 32.5 mN/m to 27.0 mN/m compared with before optimization.

Key words： petroleum-degrading bacteria； biosurfactant； fermentation； response surface analysis； optimization

石油開(kāi)采過(guò)程中由于原油泄漏所造成的石油污染是當(dāng)前重要的環(huán)境問(wèn)題，土壤受到石油的污染會(huì)造成性質(zhì)的改變，從而使植被及農(nóng)作物難以生長(zhǎng)[1]。針對(duì)石油污染土壤的修復(fù)，當(dāng)前研究的熱點(diǎn)集中于生物修復(fù)，即采用石油烴降解菌等微生物對(duì)石油的降解從而達(dá)到凈化土壤的目的[2]。在石油烴降解菌降解石油的過(guò)程中，其限制步驟主要是石油污染物從土壤到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的傳遞速率，而表面活性物質(zhì)的參與可加速該傳遞過(guò)程[3]。

生物表面活性劑是某些微生物代謝產(chǎn)生的大分子物質(zhì)，它們具有表面活性，既有親水性，又有疏水性。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有無(wú)毒、可生物降解、高效的乳化性和環(huán)境相容性等優(yōu)點(diǎn)[4，5]，這些優(yōu)點(diǎn)決定了生物表面活性劑在石油污染環(huán)境的生物修復(fù)中扮演重要角色。目前，針對(duì)生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選、鑒定、代謝產(chǎn)物的分析及發(fā)酵條件的優(yōu)化等方面已展開(kāi)了部分研究[6-8]。但對(duì)石油烴降解菌產(chǎn)生物表面活性劑條件優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道卻較少，且主要局限于采用單因素和正交試驗(yàn)的方法[9]。

響應(yīng)面分析法是采用多項(xiàng)式來(lái)模擬多因子試驗(yàn)中各因素彼此間的相互關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建響應(yīng)面，通過(guò)響應(yīng)面的函數(shù)分析來(lái)研究因子相互之間的關(guān)系，并對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，由于這種方法設(shè)計(jì)合理，優(yōu)化結(jié)果較為優(yōu)良，故當(dāng)前被越來(lái)越多的生物、食品行業(yè)人員所采用[10]。本試驗(yàn)以從長(zhǎng)慶油田分離得到的石油烴高效降解菌CQ6作為試驗(yàn)菌株，利用單因素試驗(yàn)考察了其發(fā)酵液表面張力和石油降解率，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出一組產(chǎn)生物表面活性劑的最適條件，以期為生物表面活性劑的開(kāi)發(fā)和長(zhǎng)慶油田石油土壤的原位修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)所用的石油烴高效降解菌菌株CQ6分離自長(zhǎng)慶油田石油污染土壤，鑒定結(jié)果為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），菌株由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，試驗(yàn)用油采自長(zhǎng)慶油田第三采油廠。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基與儀器 ①試劑：石油醚、無(wú)水硫酸鈉、硫酸，均為分析純。②培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。③儀器：WZY-1自動(dòng)液體表面張力儀，上海衡平制造廠；759S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素試驗(yàn) 試驗(yàn)考察了不同溫度、pH、轉(zhuǎn)速和初始加油量對(duì)石油烴降解菌菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的影響。

1.2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以溫度（A）、轉(zhuǎn)速（B）和初始加油量（C）作為自變量，發(fā)酵液表面張力（Y）為響應(yīng)值，做3因素3水平的響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

試驗(yàn)菌株所產(chǎn)表面活性劑性能測(cè)定采用表面張力檢測(cè)法[11]，使用張力儀檢測(cè)發(fā)酵液的表面張力。試驗(yàn)菌株對(duì)原油的降解率測(cè)定采用紫外分光光度法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的影響 溫度可影響微生物的生長(zhǎng)與繁殖速率，在初始加油量4%，培養(yǎng)基pH 7.0時(shí)，試驗(yàn)將培養(yǎng)基分別置于15、20、25、30、35、40 ℃下，在轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)24 h，分別測(cè)定各發(fā)酵液的表面張力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)溫度低于20 ℃和高于40 ℃時(shí)，發(fā)酵液的表面張力均較大，表明菌體代謝產(chǎn)生物表面活性劑的能力均較弱，而在溫度為25～35 ℃時(shí)，菌體可很好地生長(zhǎng)并代謝產(chǎn)生表面活性劑，基于此結(jié)果，將25～35 ℃作為菌體產(chǎn)生物表面活性劑的最適溫度范圍。

2.1.2 pH對(duì)菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的影響 pH可通過(guò)影響細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性來(lái)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響菌體生長(zhǎng)，進(jìn)而影響生物表面活性劑的產(chǎn)量。在初始加油量4%時(shí)，將培養(yǎng)基的pH分別設(shè)置為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，測(cè)定各發(fā)酵液的表面張力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，菌株CQ6在pH為6.5～7.5時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較好，所產(chǎn)生物表面活性劑較多，菌株發(fā)酵液的表面張力較低，且彼此間無(wú)較大差異，但當(dāng)pH低于6.5或高于7.5時(shí)，發(fā)酵液的表面張力明顯增加，表明此時(shí)菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的能力明顯下降，菌株的生長(zhǎng)受到抑制，基于此結(jié)果，將pH（6.5～7.5）選為菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的最適pH范圍。

2.1.3 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的影響 搖床的轉(zhuǎn)速?zèng)Q定了菌株發(fā)酵液中的氧溶解量，由于石油烴降解菌降解石油通常是有氧代謝，故氧是石油烴降解菌CQ6降解石油過(guò)程中不可或缺的重要因素，轉(zhuǎn)速的大小直接決定了菌株數(shù)量的多少，進(jìn)而影響生物表面活性劑的產(chǎn)量。將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為140、160、180、200、220、240、260 r/min，于30 ℃、初始加油量4%、pH 7.0的條件下分別培養(yǎng)24 h，測(cè)定各發(fā)酵液的表面張力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株CQ6在轉(zhuǎn)速為180～220 r/min時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較好，產(chǎn)生物表面活性劑較多，表現(xiàn)為菌株發(fā)酵液的表面張力較低，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速低于160 r/min和高于240 r/min時(shí)，發(fā)酵液的表面張力均有明顯提升，表明此時(shí)菌株活性降低，產(chǎn)生物表面活性劑的能力也下降。推測(cè)其原因一方面是轉(zhuǎn)速過(guò)低導(dǎo)致氧溶解量不足，從而引起菌體代謝減緩，產(chǎn)生物表面活性劑能力下降；另一方面是轉(zhuǎn)速過(guò)高導(dǎo)致過(guò)量的氧溶解，引起菌體將所產(chǎn)的生物表面活性劑也作為碳源消耗掉，最終導(dǎo)致生物表面活性劑產(chǎn)量下降?；诖?，將180～220 r/min設(shè)置為產(chǎn)生物表面活性劑的最適轉(zhuǎn)速范圍。

2.1.4 初始加油量對(duì)菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響 試驗(yàn)中所加入的原油是菌株CQ6惟一的碳源，因此初始加油量的多少直接影響菌體的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而影響菌株生物表面活性劑的產(chǎn)量。本研究將初始加油量分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%、6%，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，于30 ℃、pH 7.0的條件下分別培養(yǎng)24 h，測(cè)定各發(fā)酵液的表面張力，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)初始加油量低于3%時(shí)，發(fā)酵液的表面張力較高，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)狀態(tài)不好，所產(chǎn)的生物表面活性劑不多，再次證明了充足的碳源會(huì)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)并產(chǎn)生生物表面活性劑；初始加油量在3%～5%時(shí)，發(fā)酵液表面張力明顯下降，說(shuō)明菌體在大量生長(zhǎng)并產(chǎn)生生物表面活性劑，然而當(dāng)初始加油量高于5%時(shí)，發(fā)酵液的表面張力有大幅度提升，推測(cè)可能的原因是初始加油量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致油層覆蓋于培養(yǎng)基表面，初始加油量越大，則石油烴降解菌CQ6所能獲得的氧氣就越少，氧氣的缺乏可抑制菌株的正常生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致由菌株代謝所產(chǎn)的生物表面活性劑的產(chǎn)量也有所降低，進(jìn)而菌株發(fā)酵液表面張力就會(huì)升高?；谝陨辖Y(jié)果，將初始加油量設(shè)置為3%～5%作為產(chǎn)生物表面活性劑的最適加油量范圍。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析法方案及結(jié)果 以溫度（A）、轉(zhuǎn)速（B）、初始加油量（C）為變量，以菌株發(fā)酵液的表面張力（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 采用軟件Expert 8.0對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，構(gòu)建出多元二次方程：

Y=29.57+0.50A-0.42B-0.09C+0.60AB-1.20AC+0.58BC-0.65A2-0.77B2-0.32C2+1.32A2B，各個(gè)因素的方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，模型的P為0.020 5，小于0.05，說(shuō)明回歸模型顯著，失擬項(xiàng)P為0.930 5，說(shuō)明模型可靠，用該模型對(duì)石油降解菌CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果準(zhǔn)確。

根據(jù)回歸方程，獲得溫度、轉(zhuǎn)速和初始加油量彼此間兩兩交互對(duì)菌株發(fā)酵液表面張力的影響，圖5、圖6和圖7為相應(yīng)的響應(yīng)面曲線圖。由圖5、圖6、圖7可知，溫度、轉(zhuǎn)速和初始加油量彼此間兩兩交互對(duì)發(fā)酵液表面張力的響應(yīng)值均存在最小值，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析，3個(gè)影響菌體發(fā)酵液表面張力的關(guān)鍵因素溫度、轉(zhuǎn)速、初始加油量的最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)分別是25 ℃、190.40 r/min、3.41%，在此條件下，預(yù)測(cè)其表面張力為26.893 7 mN/m。

2.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化驗(yàn)證 為了便于操作，將發(fā)酵的最優(yōu)條件適度調(diào)整為溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速190 r/min、初始加油量3.4%。經(jīng)檢測(cè)，在優(yōu)化前，菌株CQ6在搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，溫度為30 ℃，初始加油量為4%的條件下，對(duì)石油烴的降解率為64.4%，菌株發(fā)酵液的表面張力為32.5 mN/m；優(yōu)化后，在溫度為25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為190 r/min，初始加油量為3.4%時(shí)，發(fā)酵液的表面張力降低至27.0 mN/m，較優(yōu)化之前降低了16.9%，對(duì)石油烴的降解率提高至80.2%，較優(yōu)化之前提高了15.8個(gè)百分點(diǎn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)慶油田高效石油烴降解菌CQ6進(jìn)行了石油降解率和發(fā)酵液表面張力的研究，并采用Box-Benhnken和響應(yīng)面分析法對(duì)該菌產(chǎn)表面活性劑的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出在溫度為25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為190.40 r/min，初始加油量為3.41%時(shí)，菌株發(fā)酵液表面張力預(yù)測(cè)值為26.893 7 mN/m。為檢驗(yàn)該設(shè)計(jì)的可靠性，采用上述預(yù)測(cè)條件進(jìn)行發(fā)酵，為了便于操作，將發(fā)酵的最優(yōu)條件適度調(diào)整為溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速190 r/min、初始加油量3.4%，在此條件下，測(cè)得菌株發(fā)酵液的實(shí)際表面張力為27.0 mN/m，接近理論預(yù)測(cè)值。由此可得，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌株CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵工藝，所得最佳條件可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前對(duì)石油烴降解菌的研究主要集中于石油烴降解菌的篩選及降解性能的測(cè)定[13-15]，但有關(guān)石油烴降解菌所產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件優(yōu)化的研究卻相對(duì)較少，且主要集中于單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。但上述方法存在下列缺陷：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)不考慮因素間的交互作用，正交分析又無(wú)法找出各個(gè)因素的最佳組合[16，17]。采用響應(yīng)面分析法可克服上述存在的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化石油烴降解菌CQ6產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵工藝，此發(fā)酵工藝可使發(fā)酵液的表面張力比優(yōu)化之前降低16.9%，對(duì)石油烴的降解率比優(yōu)化之前提高15.8個(gè)百分點(diǎn)。

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