程兆宇，房磊（.吉林電子信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林吉林30；.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林30）

富硒茶樹菇的硒提取工藝及抗疲勞效果研究

程兆宇1，房磊2
（1.吉林電子信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林吉林132021；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

摘要：為了探討富硒茶樹菇中硒的提取工藝以及抗疲勞功效，通過單因素試驗(yàn)確定富硒茶樹菇中硒的提取工藝：提取次數(shù)2次，提取時(shí)間7 h，堿液濃度0.075mol/L，提取溫度60℃，料液比1∶20（g/mL）。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，根據(jù)回歸分析確定各工藝的影響因子，以提取所得硒含量為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等值線圖，確定富硒茶樹菇中硒的最佳提取工藝條件為：堿液濃度為0.073mol/L，提取時(shí)間為6.91 h，提取料液比為1∶24.9（g/mL），在此工藝基礎(chǔ)上，預(yù)測茶樹菇的硒含量為22.82μg/g。此外，對含硒溶液的抗疲勞作用進(jìn)行了研究，得到結(jié)果：硒能顯著提高小鼠的生命力，增強(qiáng)其耐力，延遲感覺疲勞的時(shí)間。

關(guān)鍵詞：富硒茶樹菇；硒；抗疲勞；耐力

茶樹菇（Agrocybe cylindracea），又名茶薪菇、楊樹菇、柱狀田頭菇等，為層菌綱糞銹傘科田菌屬真菌，被人們稱為“菇中珍品”[1]。集高蛋白，低脂肪，低糖份，保健食療于一身的純天然無公害保健食用菌，具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[2-3]。經(jīng)過優(yōu)化改良的茶樹菇，蓋嫩柄脆，味純清香，口感極佳，可烹制成各種美味佳肴，其營養(yǎng)價(jià)值超過香菇等其他食用菌，屬高檔食用菌

硒作為動物及人體的必需微量元素，含量僅20mg左右，其生物功能廣泛，參與構(gòu)成的硒蛋白和硒酶可作用于心臟、血細(xì)胞、骨骼肌和線粒體等多個(gè)方面，直接與人體健康密切相關(guān)，從而影響著人體的運(yùn)動能力[5-7]。大量研究表明，硒可以對抗運(yùn)動訓(xùn)練所致的氧化傷害[8]；改善運(yùn)動所致的免疫機(jī)能下降[9]。相關(guān)調(diào)查表明，我國部分運(yùn)動員的血清硒水平明顯偏低，除年齡、性別等混雜因素，運(yùn)動訓(xùn)練造成的影響是最關(guān)鍵的[10]，故人體營養(yǎng)元素硒的補(bǔ)充是十分必要的，因此硒勢必會成為人們研究的焦點(diǎn)。

硒在水果中的生理活性及硒含量的測定，今后也是研究的重點(diǎn)方向[11-13]，此外在靈芝中的研究也較多[14-15]。在食用菌方面，田敏爵等對富硒猴頭菇的含硒蛋白的提取工藝進(jìn)行了研究[16]，王連芳則是對硒蛋白的提取工藝的優(yōu)化進(jìn)行了研究[17]，姚敏等研究指出蛋白硒是硒的主要賦存形態(tài)，占總硒的73.6%～77.4%，核酸和多糖結(jié)合硒量甚少，在蛋白質(zhì)組份中，以堿溶性蛋白質(zhì)結(jié)合硒量最高，占總硒的23.0%～25.2%[18]。

本文探討茶樹菇中的硒提取工藝，響應(yīng)面進(jìn)行了優(yōu)化，并對其抗疲勞作用進(jìn)行了討論，為茶樹菇在運(yùn)動營養(yǎng)的開發(fā)和應(yīng)用提供理論參考。

1　材料和方法

1.1材料和試劑

鹽酸：西隴化工股份有限公司；氫氧化鉀、硼氫化鉀、鐵氰化鉀：廣州友聯(lián)化學(xué)試劑廠；硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液（質(zhì)量濃度為1.000 g/L）、硒標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（質(zhì)量濃度為0.001 g/L）：安徽宇寧科技有限公司。

健康的昆明雄性小鼠，體重18 g～21 g，由長春應(yīng)化所提供，合格證號：滬動合證字155號。生長環(huán)境溫度20℃～25℃，相對濕度50%～70%。

1.2設(shè)備與儀器

FA1004A分析天平：上海達(dá)平儀器有限公司；LXJ離心沉淀機(jī)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AFS-230E原子熒光分光光度計(jì)：北京陽光億事達(dá)有限公司；80-1電動離心機(jī)：金壇市科希儀器有限公司；JJ-2型均質(zhì)機(jī)：蘇州江東精密儀器有限公司；恒溫游泳箱：北京陽光億事達(dá)有限公司。

1.3提取工藝和測定方法

富硒茶樹菇→組織粉碎→添加KOH攪拌→加熱提取→冷卻→添加鹽酸和鐵氯酸鉀溶液→離心分離

采用（GB 5009.93-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定》）原子熒光分光光度計(jì)自動測試。測試條件為負(fù)高壓：300V；燈電流：80mA；原子化溫度：80℃；爐高：8mm；載氣流速：400L/min；屏蔽氣流速：1000mL/min；測量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；延遲時(shí)間：0.1 s；讀數(shù)時(shí)間：10 s；加液時(shí)間：8 s；進(jìn)樣體積：2m L[18]。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：分別取0.00、0.10、0.20、0.30、 0.40、0.50、0.60mL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液于15mL比色管中，用亞沸水定容至10.0mL，再分別加濃鹽酸2.0mL，鐵氰化鉀1.00mL，混勻，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。上機(jī)測定，記錄數(shù)顯示熒光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve

1.5樣品的測定

設(shè)定好儀器最佳條件，在試樣參數(shù)畫面，輸入以下參數(shù)：試樣質(zhì)量（g或mL），稀釋體積（m L），并選擇結(jié)果的濃度單位，逐步將爐溫升至所需溫度后，穩(wěn)定10 min～20min后開始測量。

連續(xù)用標(biāo)準(zhǔn)系列的零管進(jìn)樣，待讀數(shù)穩(wěn)定之后，轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)系列測量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.在轉(zhuǎn)入試樣測定之前，再進(jìn)入空白值測量狀態(tài)，用試樣空白消化液進(jìn)樣，讓儀器取其均值作為的空白值，隨后對試樣進(jìn)行測量。

1.6小鼠抗疲勞實(shí)驗(yàn)：游泳負(fù)重實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)10只小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，組間的實(shí)驗(yàn)小鼠體重經(jīng)t檢驗(yàn)無顯著性差異?？瞻讓φ战M及低、中、高3個(gè)劑量硒溶液的實(shí)驗(yàn)組，其中低、中、高劑量組分別按人體攝入量的5、10、30倍，即12.5、25、75 m L/（kg· bw），空白對照組按相同體積純凈水進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：小鼠尾根負(fù)重，重量為體重的5%，末次給藥30 min，將小鼠至于水深30 cm、水溫（25±0.5）℃的游泳箱中，記錄從游泳開始至死亡的時(shí)間（min），作為小鼠的游泳時(shí)間[19]。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用X±SD表示應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差分析采用ANOVA，多重比較采用Duncan’s法。

2　結(jié)果與討論

2.1影響硒提取的單因素分析

2.1.1浸提次數(shù)的影響

一次堿提不能將所有硒溶出，多次進(jìn)行浸提是十分必要的。將一次浸提之后的殘?jiān)?，用第一次浸提相同濃度的堿液，攪拌、離心、取上清液，重復(fù)上述過程，進(jìn)行第3次，第4次硒的提取，結(jié)果如圖2所示。

圖2　提取次數(shù)的選擇Fig.2　Extraction timesof choice

如圖2可知，浸提2次后，能有效的將硒充分提出，2次后，浸提結(jié)果差異不顯著，殘?jiān)静缓?，故確定浸提次數(shù)為2次為宜。

2.1.2浸提時(shí)間的影響

分別選擇提取時(shí)間5、6、7、8、9 h進(jìn)行試驗(yàn)，提取所得硒含量結(jié)果如圖3。

圖3　提取時(shí)間的選擇Fig.3　Selectextraction time

由圖3可知，隨浸提時(shí)間的延長，提取出的硒含量不斷提高，但7 h后，提取率的增長趨勢趨于平緩，故選擇7 h為最佳硒提取時(shí)間。

2.1.3堿液濃度的影響

分別選取 0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mol/L的堿液進(jìn)行提取，所得硒含量結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取堿液濃度的選擇Fig.4　Extraction alkaliconcentration of choice

由圖4可知，堿溶液濃度增加，浸提出的硒含量增加，堿濃度小于0.075mol/L時(shí)，變化幅度較大，后變化趨勢趨于平緩，變化不顯著，故選擇0.075mol/L為浸提時(shí)堿液濃度。

2.1.4溫度的影響

分別選取50、60、70、80、90℃進(jìn)行提取，所得硒含量結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取溫度的選擇Fig.5　Extraction temperature selection

由圖5可知，隨著溫度的升高，硒含量逐漸提高，提取效果越好，硒有一部分是以硒蛋白形式存在，其變性溫度為70℃～80℃，故選擇60℃為浸提溫度。

2.1.5料液比的影響

分別選取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL）進(jìn)行提取過程，所得硒含量結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取料液比的選擇Fig.6　Extractsolid-liquid ratio selection

由圖6可知，隨著料液比的增大，硒的含量越大，但料液比在1∶30（g/mL）后，變化趨于平緩，差異不顯著，故選擇1∶30（g/m L）為最佳料液比。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

以提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間、堿液濃度和料液比為單因素，確定最佳的提取工藝，以其試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，以堿液濃度、提取時(shí)間和料液比為條件，以硒含量為響應(yīng)值，研究其對富硒茶樹菇中硒提取率的影響，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，因素水平表見表1。

表1　響應(yīng)面優(yōu)化因素水平表Table1　Factorsand levelsof Box-Behnken test

依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行工藝優(yōu)化，其試驗(yàn)組合及結(jié)果如表2所示，方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Design and data from the Box-Behnken test

表3　試驗(yàn)結(jié)果回歸分析Table 3　Regression nanlysis

據(jù)表2結(jié)果計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，以回歸系數(shù)建立硒含量與堿液濃度A、提取時(shí)間B和料液比C 3個(gè)因子的數(shù)學(xué)回歸模型，模型回歸檢驗(yàn)F=83.73，在0.01水平上差異極顯著。失擬檢驗(yàn)F=0.88，差異不顯著，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。編碼因素A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2差異顯著，優(yōu)化模型的編碼方程為：Y=22.42-0.98 A-1.05 B+1.88 C-1.07 AB+1.62 AC+1.02 BC-2.31 A2-3.43 B2-2.52C2。

2.2.2響應(yīng)面分析與優(yōu)化

從回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，堿液濃度A和料液比C的互作效應(yīng)對茶樹菇硒含量的得率影響，根據(jù)二次回歸方程繪制的響應(yīng)面結(jié)果如圖7所示。

圖7　富硒茶樹菇的提取響應(yīng)面圖Fig.7　Se-enriched Agrocybe cylindracea extracta response surface plot

從圖7a可知，料液比一定時(shí)，在選定的條件范圍內(nèi)，提取效果較好的值都落在了堿液濃度和提取時(shí)間的中間區(qū)域。保持提取時(shí)間固定，硒含量隨堿液濃度增加而增大，0.065mol/L～0.075mol/L時(shí)達(dá)最大值；保持堿液濃度固定，硒含量隨提取時(shí)間延長而增大，在6 h～7 h時(shí)達(dá)到最大值。

從圖7b可知，提取時(shí)間一定時(shí)，在選定的條件范圍內(nèi)，提取效果較好的值都落在了堿液濃度和料液比的中間區(qū)域。保持堿液濃度固定，茶樹菇硒含量隨料液比減小而增大，在1∶9.7（g/m L）～1∶25.3（g/m L）達(dá)最大值，之后逐漸減少；保持料液比固定，樣品硒含量隨堿液濃度增加而增大，0.068mol/L～0.072mol/L達(dá)最大值。

從圖7c可知，堿液濃度一定時(shí)，在選定的條件范圍內(nèi)，提取效果較好的值都落在了提取時(shí)間和料液比的中間區(qū)域。保持提取時(shí)間固定，茶樹菇硒含量隨料液比減小而增大，在1∶19.4（g/mL）～1∶24.8（g/mL）達(dá)最大值；保持料液比固定，樣品硒含量隨提取時(shí)間延長而增加，6.7 h～7.1 h達(dá)到最高值。

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，茶樹菇硒提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為堿液濃度為0.073mol/L，提取時(shí)間為6.91 h，提取料液比為1∶24.9（g/mL），在此工藝基礎(chǔ)上，預(yù)測茶樹菇的硒含量為22.82μg/g。為進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)面分析結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測定樣品硒含量為22.53μg/g，與理論值相比，誤差較小，因此，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。

2.3提取物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

提取物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響結(jié)果見表4。

表4　不同劑量硒溶液對小鼠體重及負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table4　Effectsof extraetson thebodyweightand exhaustiue sw im times ofm ice

灌胃30 d后，小鼠的體重較初始時(shí)體重有所增加，各組之間不存在顯著性差異（P＞0.05），所以硒提取物未影響小鼠的正常發(fā)育。相對于對照組低劑量組小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間顯著增加（P<0.05），中、高劑量組的負(fù)重游泳時(shí)間極顯著增加（P<0.01），其中高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為31.6min，較對照組提高了將近3倍，如表4表明，茶樹菇的含硒提取物能顯著增強(qiáng)小鼠耐力。

3結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化，得到富硒茶樹菇的最佳提取工藝：茶樹菇硒提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為堿液濃度為0.073mol/L，提取時(shí)間為6.91 h，提取料液比為1∶24.9（g/mL），在此工藝基礎(chǔ)上，預(yù)測茶樹菇的硒含量為22.82μg/g，實(shí)際測定值為22.53μg/g。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了硒溶液的抗疲勞實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分析可知：硒溶液灌胃后不影響小鼠的正常生長狀況；低、中、高3劑量均顯著增加了小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，延緩了小鼠疲勞感的出現(xiàn)，增強(qiáng)其運(yùn)動耐力。故茶樹菇可成為運(yùn)動營養(yǎng)食品的來源，下一階段的工作是茶樹菇運(yùn)動食品的研發(fā)，為抗疲勞飲料或食品的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.21.009

作者簡介：程兆宇（1982—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：運(yùn)動營養(yǎng)保健。類。茶樹菇的研究主要其中在多糖的提取及應(yīng)用[4]，富硒茶樹菇硒的提取研究較少，如何經(jīng)濟(jì)有效的提取茶樹菇的營養(yǎng)元素硒，可成為茶樹菇的重點(diǎn)深入研究方向。

收稿日期：2014-12-03

Study on the Extraction Technology of Se-enriched Agrocybe Cylindracea and Anti-fatigue Effect

CHENG Zhao-yu1，F(xiàn)ANG Lei2
（1.Jilin Collegeof Electronic Information，Jilin 132021，Jilin，China；2.Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Abstract：In order to study the extraction processof selenium in Se-enriched Agrocybe cylindracea and antifatigueeffect.The experimentdetermined the extraction processof Se in Se-enriched Agrocybe cylindraceabya single factor：extraction times was 2，extraction time was 7 h，lye solution was 0.075 mol/L，extraction temperaturewas60℃，and a solid-to-solvent ratiowas1∶20（g/m L）.Based on a single factor testusing three factors and three levels of response surface analysis to determine the impact of each factor based process regression analysis to extract the resulting value for the selenium content of the response and the response surface contourmap，to determine the optimum extraction conditions of Se in selenium Agrocybe cylindracea which the lye solution was 0.073 mol/L with a solid-to-solvent ratio was 1∶24.9（g/mL）for 6.91 h.The maximum predicted the selenium content under the optimized conditionswas 22.82μg/g.In addition，antifatigue effect of selenium solution were studied which showed the results：selenium could significantly improve thevitalityofmice，enhanced itsendurance，delayed timeof feeling tired.

Keywords：Se-enriched Agrocybe cylindracea；selenium；anti-fatigue；endurance