孫瑞雪，楊萍，劉琦，李曉輝，姜文俠，*（1.天津科技大學(xué)，天津300457；.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津300308）

虎皮香菇漆酶的發(fā)酵優(yōu)化

孫瑞雪1，2，楊萍2，劉琦2，李曉輝1，2，姜文俠2，*
（1.天津科技大學(xué)，天津300457；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津300308）

摘要：為制備食品級漆酶，以可用于食品的原料對虎皮香菇的漆酶發(fā)酵進行優(yōu)化，考察培養(yǎng)條件、碳源、氮源及銅離子等因素對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。確定虎皮香菇產(chǎn)漆酶的發(fā)酵培養(yǎng)基為：果糖48 g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，NH4H2PO41 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4·5H2O 1mmol/L；培養(yǎng)溫度為30℃，初始pH自然，種齡3 d，接種量6%（體積比），裝液量150mL/500mL三角瓶，發(fā)酵1 d～4 d搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，第4 d～11 d搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，發(fā)酵液中漆酶活性達到462.59 U/mL，為優(yōu)化前的26倍。

關(guān)鍵詞：虎皮香菇；漆酶；發(fā)酵優(yōu)化

漆酶可以催化酚類、芳胺、羧酸、金屬有機化合物以及一些甾類激素和生物色素等超過250種底物。由于漆酶特殊的催化性能和廣泛的作用底物，漆酶在木質(zhì)素降解、食品除氧、果汁澄清、紙漿漂白、麻類脫膠、有機合成以及環(huán)境污染物的降解等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，成為綠色催化研究的熱點[1-3]。

虎皮香菇（Lentinus tigrinus），屬傘菌目，側(cè)耳科，香菇屬，生于闊葉樹腐木上，是一種食用真菌，易于進

1　材料與方法

1.1菌種

虎皮香菇（Lentinus tigrinus）TIB.BPE 11072，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所發(fā)酵過程研究組保藏。

1.2主要試劑與儀器

玉米粉：梅河口市興達米業(yè)有限責(zé)任公司；發(fā)酵專用豆粕粉2980、發(fā)酵專用豆餅粉2950：北京中棉紫光生物科技有限公司；中溫黃豆餅粉、低溫黃豆餅粉、低溫粕、高溫粕：山東萬得福實業(yè)集團有限公司；α-淀粉酶：北京索萊寶科技有限公司；果糖：河北華旭制藥有限責(zé)任公司；胰蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；2，2'-連氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鈉）：Sigma；紫外可見分光光度計（TU-1810型）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；恒溫振蕩器：美國精騏有限公司；pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；低溫恒溫循環(huán)器（ILB-008-01型）：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，瓊脂15 g/L，以花生殼浸出液配制。

花生殼浸出液：粉碎的花生外殼100g，自來水1L，煮沸30min，過濾得濾液。

種子培養(yǎng)基：玉米粉30 g/L、豆粕粉15 g/L、α-淀粉酶54U/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4· 5H2O 0.04mmol/L，121℃滅菌20min。

1.4漆酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1碳源和氮源對漆酶發(fā)酵的影響

分別以不同的碳源和氮源代替發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的可溶性淀粉和蛋白胨，30℃搖床150 r/min培養(yǎng)11d。

1.4.2銅離子濃度對漆酶發(fā)酵的影響

在經(jīng)過碳源和氮源優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加CuSO4·5H2O使其終濃度為0～3 mmol/L，30℃搖床150 r/min培養(yǎng)11 d。

1.4.3培養(yǎng)條件對漆酶發(fā)酵的影響

以優(yōu)化的培養(yǎng)基，分別考察培養(yǎng)溫度（25℃～35℃）、培養(yǎng)基初始pH（3.0～7.0）、裝液量（100 mL/500 mL～250mL/500mL三角瓶）、接種量（2%～14%）、菌種種齡（2 d～5 d）及搖床轉(zhuǎn)速（150 r/min～350 r/min）對漆酶發(fā)酵的影響。

1.5漆酶活性的定義和測定方法

一個酶活單位（U）的定義是：在下述測定條件下，每分鐘催化1μmol ABTS所需的酶量。酶活計算公式為：

式中：U為酶活，U/mL；V為反應(yīng)總體積，mL；ΔOD 為420 nm吸光度的變化；n為酶液的稀釋倍數(shù)；ε420= 36 000M-1cm-1為氧化型ABTS的摩爾吸光系數(shù)；v為酶液體積，mL；t為反應(yīng)時間，min；L為比色皿的光徑，cm。

參考文獻[4]方法：控制分光光度計樣品池溫度為漆酶的最適反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)體系為3mL，向光徑為1 cm的比色皿中加入2.7m L濃度為0.05mol/L的檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.6）和0.2mL濃度為0.5mmol/L 的ABTS，混勻，再加入0.1mL稀釋至適宜倍數(shù)的酶液，混勻后迅速放入樣品池，測定最初反應(yīng)3min內(nèi)反應(yīng)液在420 nm處吸光度的變化。以加熱煮沸5min的酶液作對照。

1.6生物量的測定

以菌絲體干重表示[5]，發(fā)酵液經(jīng)離心、洗滌后收集菌絲體，置105℃烘箱中干燥至恒重。

2　結(jié)果與討論

2.1虎皮香菇的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

采用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測定虎皮香菇生長曲線和產(chǎn)酶曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　虎皮香菇的生長曲線與產(chǎn)酶曲線Fig.1　Changesofbiomassand laccaseactivity during fermentation

如圖1所示，生物量在第1 d～4 d迅速增加，幾乎看不到延遲期，第4 d～10 d菌絲體生物量基本恒定，處于生長穩(wěn)定期，此后生物量逐漸下降。發(fā)酵的第2 d酶活迅速增加，至發(fā)酵11 d開始進入衰亡期酶活達到最高。因此將虎皮香菇的漆酶發(fā)酵周期定為11 d。

2.2碳源對漆酶發(fā)酵的影響

2.2.1碳源種類對漆酶發(fā)酵的影響

以不同的碳源取代發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中相同質(zhì)量的可溶性淀粉，其他條件不變，篩選適合的碳源，結(jié)果見圖2。

如圖2所示，碳源對漆酶發(fā)酵的影響很大，以葡萄糖為碳源時發(fā)酵液的酶活最高，達到28.83U/mL，其次為麥芽糖和果糖。

2.2.2碳源濃度對漆酶發(fā)酵的影響

分別以濃度為20 g/L～100 g/L的葡萄糖、麥芽糖和果糖為碳源，考察碳源濃度對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖2 碳源種類對漆酶發(fā)酵的影響Fig.2　Effectof carbon sourceson laccase ferm entation

圖3 碳源濃度對漆酶發(fā)酵的影響Fig.3　Effectof carbon sourcesconcentration on laccase ferm en tation

如圖3所示，提高碳源濃度后，以果糖為碳源時發(fā)酵液中漆酶酶活明顯提高，且優(yōu)于同濃度的葡萄糖和麥芽糖，在果糖濃度60 g/L時發(fā)酵酶活達到最大值73.6U/mL。根據(jù)此結(jié)果選用濃度為60 g/L的果糖為漆酶發(fā)酵的碳源。

2.2.3復(fù)合碳源對漆酶發(fā)酵的影響

單糖利于微生物的利用，但不利于漆酶的分泌；多糖難以被直接利用，影響菌體生長，但它有利于漆酶的合成[6]。擔(dān)子菌有利用多糖的能力，因此，將碳源總濃度定為60 g/L，以玉米粉和果糖按不同的質(zhì)量比作碳源，考察復(fù)合碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　果糖和玉米粉不同的質(zhì)量比對漆酶發(fā)酵的影響Fig.4　Effectof com posite carbon source on laccase fermentation

如圖4所示，選用復(fù)合碳源后發(fā)酵酶活顯著提高，當(dāng)果糖與玉米粉的質(zhì)量比為8∶2時酶活最高。我們認(rèn)為其原因是玉米粉為發(fā)酵過程提供了持續(xù)的碳源供給。

2.3氮源對漆酶發(fā)酵的影響

2.3.1不同有機氮源對漆酶發(fā)酵的影響

以20 g/L的葡糖糖為碳源，用不同的有機氮源取代發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中相同質(zhì)量的蛋白胨，考察有機氮源種類對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　有機氮源種類對漆酶發(fā)酵的影響Fig.5　Effectof organic nitrogen sourceon laccase fermentation

如圖5所示，有機氮源對漆酶發(fā)酵影響非常顯著，以蛋白胨為氮源時發(fā)酵液中漆酶酶活最高（30.84U/mL），其次是胰蛋白胨。

2.3.2有機氮源濃度對漆酶發(fā)酵的影響

以60 g/L的葡糖糖為碳源，分別用濃度為5 g/L～60 g/L的蛋白胨和胰蛋白胨為氮源，考察有機氮源濃度對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖6。

圖6　有機氮源濃度對漆酶發(fā)酵的影響Fig.6　Effect of organic nitrogen sou rce concen tration on laccase ferm en tation

如圖6所示，相同濃度下，胰蛋白胨優(yōu)于蛋白胨，兩種氮源濃度均在10%時酶活最高，故選用10 g/L的胰蛋白胨作為漆酶發(fā)酵的有機氮源。

2.3.3無機氮源對漆酶發(fā)酵的影響

單獨使用無機氮為氮源時，虎皮香菇菌絲體生物量較少，酶活較低，因此，在以胰蛋白胨為有機氮源的基礎(chǔ)上添加無機氮，考察添加無機氮對漆酶發(fā)酵的影響。胰蛋白胨與無機氮按8∶2的質(zhì)量比添加，結(jié)果見圖7。

圖7 無機氮對漆酶發(fā)酵的影響Fig.7　Effect of inorganic nitrogen source on laccase ferm entation

如圖7所示，當(dāng)以磷酸二氫銨為無機氮源時酶活較高，其次是硫酸銨，故選用磷酸二氫銨作為漆酶生產(chǎn)的無機氮源。

2.3.4復(fù)合氮源對漆酶發(fā)酵的影響

為考察有機氮源和無機氮源對虎皮香菇發(fā)酵漆酶的協(xié)同作用，將氮源總濃度定為10 g/L，胰蛋白胨和磷酸二氫銨按不同的質(zhì)量比作復(fù)合氮源，結(jié)果見圖8。

圖8 復(fù)合氮源對漆酶發(fā)酵的影響Fig.8　Effectof com positenitrogen source on laccase fermentation

如圖8所示，當(dāng)胰蛋白胨和磷酸二氫銨的質(zhì)量比為9∶1時，發(fā)酵酶活最高，是使用單一氮源的1.17倍。

2.4培養(yǎng)基中Cu2+濃度對漆酶發(fā)酵的影響

漆酶分子中含有銅離子，因此考察銅離子濃度對發(fā)酵的影響。在碳氮源優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加CuSO4·5H2O，使其在培養(yǎng)基中的濃度為0～3mmol/L，結(jié)果見圖9。

圖9　銅離子濃度對漆酶發(fā)酵的影響Fig.9　Effectof copper ion concentration on laccase fermentation

如圖9所示，培養(yǎng)基中不添加Cu2+時發(fā)酵酶活僅為0.54U/mL，但銅離子濃度過高也會對菌株有毒害作用，不利于產(chǎn)酶，當(dāng)Cu2+濃度為1mmol/L時，發(fā)酵液中漆酶的酶活最高，達到321.04U/mL。

2.5Cu2+的添加時間對漆酶發(fā)酵的影響

考察Cu2+添加時間對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖10。

圖10　銅離子添加時間對漆酶生產(chǎn)的影響Fig.10　Effect of copper ion concentration on laccase ferm entation

如圖10所示，Cu2+的添加時間對發(fā)酵液中漆酶酶活有較大影響，且Cu2+添加時間與發(fā)酵液中漆酶的酶活基本呈負(fù)相關(guān)，故在發(fā)酵接種前添加Cu2+。

2.6培養(yǎng)溫度對漆酶發(fā)酵的影響

在上述培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用不同的發(fā)酵溫度，其他條件不變，考察發(fā)酵溫度對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖11。

圖11　溫度對漆酶生產(chǎn)的影響Fig.11　Effectof the incubation tem peratureon laccase fermentation

如圖11所示，在30℃～35℃之間，隨著溫度上升發(fā)酵酶活迅速下降；而在25℃～30℃之間，溫度對發(fā)酵酶活基本無影響；在較低溫度下培養(yǎng)時菌絲體生長緩慢，到達生長穩(wěn)定期的時間增加，使總發(fā)酵周期延長，不利漆酶生產(chǎn)，故將發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度設(shè)定在30℃。

2.7培養(yǎng)基初始pH對漆酶發(fā)酵的影響

考察培養(yǎng)基的初始pH對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖12。

如圖12所示，在酸性范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基初始pH的增加，發(fā)酵液中漆酶酶活逐漸增加，在pH 5.5～6.5時達到最大值（354.73 U/mL），因此采用培養(yǎng)基的自然pH 5.7。

圖12 培養(yǎng)基初始pH對漆酶生產(chǎn)的影響Fig.12　Effectof the initialpH on laccase fermentation

2.8搖瓶裝液量對漆酶發(fā)酵的影響

裝液量是影響搖瓶溶氧的指標(biāo)，考察搖瓶裝液量對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖13。

圖13　裝液量對漆酶生產(chǎn)的影響Fig.13　Effect of them edium volum eon the laccase ferm entation

如圖13所示，500 mL搖瓶裝液量為100 mL～250 mL時，隨著裝液量的增加，漆酶酶活先增加后降低，在500mL三角瓶中裝液量為125mL時，發(fā)酵酶活達到最大值334.8U/mL。考慮到漆酶發(fā)酵周期較長，蒸發(fā)量較大，將裝液量定為150mL/500mL三角瓶。

2.9接種量對漆酶發(fā)酵的影響

接種量在很大程度上影響菌體的生長與產(chǎn)物的合成，將培養(yǎng)好的液體種子按不同的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，考察接種量對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖14。

圖14　接種量對漆酶生產(chǎn)的影響Fig.14　Effectof the inou lum sizes on the laccase ferm entation

如圖14所示，當(dāng)接種量較少時，發(fā)酵液中菌體生物量較少，不利于漆酶生產(chǎn)，隨接種量增加，產(chǎn)酶增多；當(dāng)接種量達到6%后，酶活不再增加，所以接種量選定6%。

2.10種齡對漆酶發(fā)酵的影響

將不同種齡的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察種齡對漆酶發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖15。

圖15　種齡對漆酶生產(chǎn)的影響Fig.15　Effect of the seed ageon the laccase ferm entation

如圖15所示，種齡為3 d～4.5 d時發(fā)酵酶活最高，從圖1的生長曲線可見，是在對數(shù)期的后期，故將種齡確定為3 d。

2.11搖床轉(zhuǎn)速對漆酶發(fā)酵的影響

搖床轉(zhuǎn)速影響搖瓶內(nèi)的溶氧量，從而影響菌體的生長及產(chǎn)酶，考察搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖16。

圖16　轉(zhuǎn)速對漆酶發(fā)酵的影響Fig.16　Effectof the fermentation speed on laccase fermentation

如圖16所示，提高搖床轉(zhuǎn)速，發(fā)酵液溶氧量增加，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時漆酶酶活最高。

2.12搖床變速培養(yǎng)對漆酶發(fā)酵的影響

在發(fā)酵初期，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時，菌絲團聚集，不利于菌體生長及后期產(chǎn)酶，因此在菌體生長對數(shù)期，即發(fā)酵前4 d將轉(zhuǎn)速降為150 r/min，之后再提高至200 r/min。與200 r/min恒速培養(yǎng)比較，變速培養(yǎng)的發(fā)酵酶活為462.59U/mL，是恒速培養(yǎng)的1.3倍。

3　結(jié)語

在虎皮香菇漆酶發(fā)酵的第1 d～4 d，以菌絲體生長為主，漆酶產(chǎn)生較少，培養(yǎng)的4 d～11 d漆酶大量產(chǎn)生，發(fā)酵11 d時漆酶的發(fā)酵酶活最高。

優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：果糖48 g/L，玉米粉12 g/L，胰蛋白胨9 g/L，NH4H2PO41 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4·5H2O 1mmol/L，自然pH。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為30℃，種齡3 d，接種量為6%，發(fā)酵1 d～4 d轉(zhuǎn)速為150 r/min，4 d～11 d轉(zhuǎn)速為200 r/min，裝液量為150m L/500m L三角瓶，發(fā)酵周期11 d，漆酶發(fā)酵活性達到462.59 U/mL，為優(yōu)化前的26倍。

漆酶研究的歷史較長，但在我國還是新興的酶制劑產(chǎn)品，隨著食品級漆酶的國產(chǎn)化，必將推動漆酶在我國食品和飲料工業(yè)中的應(yīng)用。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.21.040

基金項目：天津市科技支撐計劃重點項目（13ZCZDSY05400）；中國科學(xué)院重點部署項目（KSZD-EW-Z-015）

作者簡介：孫瑞雪（1986—），女（漢），研究生，研究方向：發(fā)酵工程。*通信作者：姜文俠（1964—），男（漢），研究員，研究方向：發(fā)酵工程。行固體栽培和液體發(fā)酵培養(yǎng)，具有漆酶產(chǎn)量高，菌絲體和代謝產(chǎn)物可直接應(yīng)用于食品行業(yè)等優(yōu)勢，因此虎皮香菇符合制備食品級漆酶對菌種的食品安全要求。本文以可用于食品的原料優(yōu)化該菌株的漆酶發(fā)酵，提高發(fā)酵酶活。

收稿日期：2014-03-26

Ferm entation Optim ization of Laccase by Lentinus tigrinus

SUNRui-xue1，2，YANGPing2，LIUQi2，LIXiao-hui1，2，JIANGWen-xia2，*
（1.Tianjin Universityof Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory for IndustrialBiological Systemsand Bioprocessing Engineering，Key Laboratory of SystemsMicrobial Biotechnology，Tianjin Instituteof Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

Abstract：In thisstudy，for the production of food-grade laccase，the nutritional and environmental conditions of a laccase produce strain，Lentinus tigrinus，were investigated and optimized.The optimum conditions described as follows：fructose 48 g/L，corn flour 12 g/L，tryptone 9 g/L，NH4H2PO41 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4·5H2O 1 mmol/L，temperature 30℃，pH natural，inoculum age 3 d，inoculum size 6%，medium volume 150mL/500mL，rotated speed 150 r/min on 1 d-4 d and 200 r/min on 4 d-11 d. With thoseoptimum conditions，the laccaseactivity reached at462.59U/mL increasing by26 timescompared to beforeoptimcizing.

Keywords：Lentinus tigrinus；laccase；fermentation；optimization