王書超　張宇　何爽

【摘 要】 本研究以樹舌靈芝為試材，利用單因素試驗分析碳源、氮源、溫度及pH等因素對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，進一步采用Plackett-Burman設(shè)計對樹舌靈芝發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明在含20g/L玉米粉，5g/L豆粕的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基（pH5.5）中，28℃條件下振蕩培養(yǎng)7d，漆酶活性最高。

【關(guān)鍵詞】 樹舌靈芝；漆酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

漆酶（Laccase）在環(huán)境治理、制漿造紙、生物監(jiān)測、食品監(jiān)測和綠色有機合成等領(lǐng)域也發(fā)揮著重要作用[1-2]。雖然漆酶在自然界中分布廣泛，但真正具有較高漆酶產(chǎn)量的菌株并不多見[3]，且漆酶的發(fā)酵生產(chǎn)，國內(nèi)目前尚未出現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的酶量還遠遠不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需要，而主要依靠于進口，價格比較昂貴。因此，漆酶穩(wěn)定高產(chǎn)菌株的選育十分必要[4]，同時對產(chǎn)酶條件的優(yōu)化以及產(chǎn)酶調(diào)控機理的研究對于最終其規(guī)?；a(chǎn)意義重大。本研究在前期實驗確定樹舌靈芝產(chǎn)漆酶的基礎(chǔ)上，對該菌株發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，提高產(chǎn)酶效率，以便為產(chǎn)漆酶菌種的發(fā)酵生產(chǎn)及漆酶的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

菌種樹舌靈芝（Ganoderma applanatum），由吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

①PDA 培養(yǎng)基 ②發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L 、葡萄糖20g/L 、酵母膏5.0g/L、KH2PO4 3.0g/L 、MgSO4 1.5g/L 、ZnSO4 0.05g/L 、MnSO4 0 .05g/L。

1.2 試驗方法

無菌條件下，將樹舌靈芝菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng) 8 d。取活化好的菌絲塊接種于100mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 150 r/min 避光培養(yǎng)。抽濾分離發(fā)酵液，取濾液測定OD420nm吸光值。

分別以不同碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，玉米粉，小麥麩皮）、氮源（蛋白胨，尿素，硫酸銨，硝酸銨，豆粕）代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖和硫酸銨進行發(fā)酵培養(yǎng)[6-7]，以ΔOD值為指標，分析不同碳源及氮源對樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響；進一步考察不同溫度（24℃，26℃，28℃，30℃，32℃）及pH（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗對樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 不同碳源對樹舌漆酶活性的影響

如圖1所示，在淀粉，玉米粉，葡萄糖以及蔗糖4種碳源中，玉米粉為最適合的碳源，其次分別為小麥麩皮、淀粉。

2.1.4 不同pH對樹舌漆酶活性的影響

由圖4所示，當pH5.0 時漆酶活性的最大，隨著pH的升高，樹舌漆酶活性逐漸降低。但當pH為6.5時，漆酶的活性又大幅回升。對于pH的影響不能簡單認為是直接影響漆酶活性，也可能是因為改變了培養(yǎng)環(huán)境導致其他成分發(fā)生改變間接導致漆酶活性的變動。

由表2可知，最佳組合為A1B2C2D2，即培養(yǎng)基中碳源為玉米粉，氮源為豆粕，pH為5.5，發(fā)酵溫度為28℃時酶活性最高。極差分析表明，對樹舌產(chǎn)酶的影響，碳源>氮源>溫度>pH。

3 結(jié)論

在前期平板實驗初步驗證樹舌靈芝產(chǎn)漆酶活性較高的基礎(chǔ)上，通過單因素實驗與正交試驗對樹舌靈芝產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進行了分析并優(yōu)化，最終確定了適合樹舌靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最佳工藝條件。最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L 、玉米粉20g/L 、豆粕5.0g/L、KH2PO4 3.0g/L 、MgSO4 1.5g/L 、ZnSO4 0.05g/L 、MnSO4 0 .05g/L（pH5.5），28℃條件下發(fā)酵7d漆酶活性最高。雖然本研究初步確定了樹舌靈芝漆酶的發(fā)酵條件，但對于其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)還有一段距離，目前研究小組正在對樹舌靈芝進行誘變育種及下游漆酶的分離純化工藝的研究，以期望不久的將來能將研究結(jié)果推廣到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，對未來漆酶的應(yīng)用提供一定的參考。

參考文獻：

[1] 姜竹茂， 纓靜.漆酶的最新研究進展[J]. 煙臺師范學院學報（自然科學版），2001： 123-28.

[2] 劉蘋， 唐志紅， 李夢玉， 等. 金針菇漆酶活性測定的最佳反應(yīng)條件及液體培養(yǎng)胞外酶的研究[J].食品科技， 2012，（ 6） ： 14-17.

[3] 凡軍民， 高大響， 劉進華， 等. 樹舌靈芝深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J].食品與機械，2010.

[4] 潘志恒，岳鹍，孫勇民，等.樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基優(yōu)化[J] .保鮮與加工， 2016，16（4）：107-111.