祝友朋 陳搖 韓長志

摘要：膠孢炭疽菌可以侵染桃、核桃等諸多重要農(nóng)林植物，它可引起生產(chǎn)上諸多經(jīng)濟樹種的炭疽病，嚴重威脅著各國農(nóng)林業(yè)的健康生產(chǎn)。植物病原絲狀真菌中黑色素合成途徑中關(guān)鍵環(huán)節(jié)漆酶已經(jīng)在稻瘟病菌、玉米大斑病菌等進行了較為深入的研究，然而尚未見有關(guān)膠孢炭疽菌黑色素合成途徑中關(guān)鍵環(huán)節(jié)漆酶的生物信息學(xué)分析報道。本研究以膠孢炭疽菌中漆酶Cg14LAC氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過TargetP、SignalP、ProtComp、Phyre、big-PI Fungal Predictor、SMART、TMHMM等生物信息學(xué)分析工具對上述序列開展蛋白質(zhì)亞細胞定位、細胞信號肽、二級結(jié)構(gòu)、錨定位點、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域等進行分析，同時對上述序列開展與炭疽菌屬不同真菌遺傳進化關(guān)系分析。研究結(jié)果為進一步深入開展該蛋白在致病過程中所具有的功能研究打下堅實的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：農(nóng)林植物;膠孢炭疽菌;黑色素;漆酶;生物信息學(xué);遺傳進化

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiride）在分類上屬于炭疽菌屬真菌，作為引起多種農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟作物炭疽病的病原菌之一，可以危害芒果、柿樹、草莓、桃樹以及核桃等植物[1]。前人研究較多關(guān)注于該菌的形態(tài)特征、生活史以及遺傳關(guān)系、致病基因等方面[2]。近些年，隨著同屬于炭疽菌屬中的禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）、希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum）全基因組序列的公布[3]，筆者對上述病菌G蛋白信號通路相關(guān)蛋白進行生物信息分析，同時，也對該菌中重要的G蛋白信號通路調(diào)控因子RGS蛋白開展生物信息學(xué)分析[4]。

植物病原絲狀真菌能否成功侵入寄主植物組織并在其中生長繁殖，是其能否成功導(dǎo)致植物發(fā)病的基本條件之一。DHN黑色素作為植物病原菌重要的毒力因子之一，其合成途徑包括1個聚酮體合成酶基因、2個還原酶基因、2個脫水酶基因以及1個漆酶基因[5]。漆酶作為一種廣泛存在于真菌、細菌、昆蟲和植物中含銅的多酚氧化酶，能夠催化酚類化合物及其衍生物，使之生成相應(yīng)的苯醌和水[6]。目前，學(xué)術(shù)界關(guān)于漆酶在植物病原絲狀真菌中的報道較多，如稻瘟病菌[7]、灰霉菌[8]、玉米大斑病菌[9]、番茄枯萎病菌[10]等。漆酶基因與真菌的生長發(fā)育、分生孢子形成、黑色素合成、致病性等相關(guān)，但在不同植物病原真菌中的作用差異很大。就炭疽菌屬中真菌漆酶基因的研究而言，在西瓜炭疽病病菌（Colletotrichum orbiculare）中，漆酶基因1ac2調(diào)控附著胞黑色素和分生孢子色素沉著，突變后致病力喪失[11]。然而，漆酶基因lac1在黃瓜炭疽菌（Colletotrichum lagenarium）中并非是黑色素合成和對寄主致病力的必要因素[12]。芒果膠孢炭疽菌漆酶基因lac1不僅可以調(diào)控降解芒果組織中的酚類物質(zhì)、促進病原菌的擴展，也可以通過干擾與致病力相關(guān)的黑色素合成和細胞壁降解酶的產(chǎn)生來影響其致病力[13];推測1ac2可能調(diào)控分生孢子萌發(fā)，也可能參與調(diào)控其漆酶活性和抗氧化反應(yīng)等[14]。

目前，對于C. gloeosporioides黑色素合成途徑中關(guān)鍵環(huán)節(jié)漆酶的生物信息學(xué)分析尚未見報道，近些年，隨著云南省各地區(qū)大面積種植核桃[15]，各地區(qū)核桃炭疽病發(fā)生較為嚴重（韓長志等，未發(fā)表數(shù)據(jù)），因此，深入開展該菌黑色素合成相關(guān)基因的研究，可以更好地明確病原菌的致病機制[16]，對于進一步深入開展該蛋白在致病過程中所具有的功能具有非常重要的理論指導(dǎo)和生產(chǎn)實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)西瓜炭疽菌中已經(jīng)報道的漆酶蛋白LAC1、LAC2序列（蛋白編號為BAB32575、BAN13563.1）[11]，在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp比對，獲得膠孢炭疽菌 Cg-14以及Nara gc5菌株的LAC1、LAC2蛋白序列，分別命名為Cg14LAC1、Cg14LAC2、CgNLAC1、CgNLAC2。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運肽及信號肽預(yù)測 利用TargetP 1.1 Server[17]和SignalP 4.0 Server[18]分別實現(xiàn)對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運肽的預(yù)測、信號肽的預(yù)測。

1.2.2 亞細胞定位及錨定位點分析 利用ProtComp v9.0和big-PI Fungal Predictor分別實現(xiàn)蛋白的定位[19]、錨定位點情況[20]。

1.2.3 蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測及理化性質(zhì)分析 利用ExPASy[21]實現(xiàn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用SMART[22-23]實現(xiàn)對蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測;利用TMHMM Server v.2.0[18]和HMMTOP version 2.0[24]、TMpred等跨膜網(wǎng)站對蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

1.2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用Phyre2在線分析實現(xiàn)[25]。

1.2.6 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 在NCBI中找尋Cg14LAC1、Cg14LAC2的同源序列，利用ClustalX[26]進行多重比對分析，隨后利用MEGA 7.0軟件[27]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

通過對膠孢炭疽菌中Cg14LAC1、Cg14LAC2、CgNLAC1、CgNLAC2序列進一步分析，結(jié)果表明，Cg14LAC1比CgNLAC1序列多43個氨基酸，位置為第334～376氨基酸，推測可能原因在于測序結(jié)果不準確或者自然原因丟失，尚不能確定，而Cg14LAC2與CgNLAC2序列相同。為了更好地開展膠孢炭疽菌中漆酶蛋白的生物信息學(xué)分析，因此，本研究選擇Cg14LAC1、Cg14LAC2進行后續(xù)分析。

2.2 轉(zhuǎn)運肽、信號肽以及亞細胞定位、錨定位點預(yù)測

通過對Cg14LAC1與Cg14LAC2的信號肽分析，上述蛋白均具有明顯的信號肽序列，位置分別為第22、23位和第23、24位，最大切割率均為0.450，上述蛋白均屬于分泌蛋白;進一步對其轉(zhuǎn)運肽、亞細胞定位以及錨定位點進行分析，轉(zhuǎn)運肽分析結(jié)果表明，上述蛋白均定位在線粒體上，但其預(yù)測可靠性概率不同（表1），同時，亞細胞定位分析結(jié)果表明，上述蛋白定位于胞外，可結(jié)合在膜上（表2）;盡管如此，通過對上述蛋白進行錨定位點的預(yù)測分析，并未發(fā)現(xiàn)上述蛋白含有錨定位點。

2.3 疏水性及理化性質(zhì)分析預(yù)測

通過對Cg14LAC1與Cg14LAC2進行疏水性預(yù)測，明確Cg14LAC1中位于第132位的蘇氨酸（T），其親水性最強（-3.267），而位于第16位的亮氨酸（L），疏水性最強（2.044）;與Cg14LAC1不同，Cg14LAC2中位于第375位的谷氨酰胺（Q），親水性最強（-2.889）;而位于第15位的亮氨酸（L），疏水性最強（2.489）（表3）。

一般而言，組成蛋白質(zhì)的氨基酸種類可以分為酸性氨基酸、堿性氨基酸、非極性R基氨基酸以及不帶電荷的極性R基氨基酸等4類。對Cg14LAC1與Cg14LAC2氨基酸組成進行分析，明確上述蛋白在氨基酸組成方面，無論是數(shù)量，還是在所占比例方面均沒有太大的差別（表5）。

2.4 保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

通過對Cg14LAC1與Cg14LAC2進行疏水性預(yù)測，明確上述蛋白均不含有保守的結(jié)構(gòu)域;同時，利用HMMTOP以及TMHMM進行分析，上述蛋白均不具有跨膜區(qū);進一步通過TMpred分析，發(fā)現(xiàn)Cg14LAC1具有2個跨膜區(qū)，Cg14LAC2具有1個跨膜區(qū)（表6），推測上述跨膜結(jié)構(gòu)應(yīng)為前期預(yù)測的信號肽更為準確。因此，膠孢炭疽菌中Cg14LAC1是否具有跨膜區(qū)域有待進一步通過生物學(xué)試驗進行驗證，而Cg14LAC2不具有跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及組成情況分析

目前，預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的常用方法除Phyre[28]和PSIPRED[29]外，還有PHD等方法。上述方法所得結(jié)果基本相似，本研究以Phyre所分析結(jié)果為例，明確膠孢炭疽菌中Cg14LAC1和Cg14LAC2蛋白含有α螺旋、無規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角、TM螺旋等結(jié)構(gòu)（圖1），各結(jié)構(gòu)所占比例大體相當(dāng)。

2.6 遺傳關(guān)系分析

以Cg14LAC1、Cg14LAC2為基礎(chǔ)序列，通過BLASTp同源性搜索，獲得與膠孢炭疽菌漆酶具有同源性的炭疽菌屬不同真菌的氨基酸序列，根據(jù)其同源關(guān)系數(shù)值，結(jié)合Cg14LAC1、Cg14LAC2序列，利用MEGA 7.0進行系統(tǒng)進化分析，明確膠孢炭疽菌Cg14PLC1與Cg14PLC2分別形成具有不同群體的2類（數(shù)據(jù)未顯示），Cg14PLC1與膠孢炭疽菌中另外一個菌株Nara gc5中的CgNPLC1（XP_007283028.1）序列相同，與同屬于炭疽菌屬的其他真菌C. orbiculare中的ENH79795.1親緣關(guān)系較近;Cg14PLC2則與膠孢炭疽菌中的AFK76451.1親緣關(guān)系較近，并與菌株Nara gc5中的CgNPLC2（XP_007273654.1）聚為一類。

3 討論

前期，利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫，對膠孢炭疽菌中漆酶蛋白進行“Colletotrichum gloeosporioides AND laccases”關(guān)鍵詞搜索，結(jié)果表明有57個蛋白，對上述蛋白逐一查看，去除西瓜炭疽菌中的漆酶蛋白，剩余46個蛋白，對這些蛋白開展遺傳關(guān)系分析，可以分為13個小類，該結(jié)果表明膠孢炭疽菌在不同炭疽菌屬種中的漆酶蛋白并不具有較強的保守性，該結(jié)果為進一步解釋膠孢炭疽菌可以侵染諸多農(nóng)林植物提供新的研究思路。

同時，由于膠孢炭疽菌全基因組序列并未完全釋放，本研究根據(jù)同屬于炭疽菌屬的西瓜炭疽菌中已經(jīng)報道的LAC1、LAC2進行BLASTp比對，從而獲得膠孢炭疽菌Cg-14、Nara gc5菌株中的LAC1、LAC2，并對其開展包括二級結(jié)構(gòu)、疏水性、理化性質(zhì)等全面的生物信息學(xué)分析預(yù)測工作，為進一步開展引起核桃炭疽病的炭疽病菌中漆酶的功能研究提供重要的理論參考。

膠孢炭疽菌是造成多種農(nóng)林業(yè)上植物產(chǎn)生重要損失的病原菌之一[30-31]，它主要通過產(chǎn)生附著胞利用機械壓力穿透植物侵入寄主。黑色素是否合成直接關(guān)系到病原菌附著胞能夠形成巨大膨壓從而侵入寄主組織，因此，開展該病菌菌黑色素合成相關(guān)基因的研究對于進一步解析病原菌致病機制具有重要的理論意義，同時，也為進一步開發(fā)適合于今后生產(chǎn)上適用的靶標殺菌劑具有重要的應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究以膠孢炭疽菌中漆酶Cg14LAC氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過TargetP、SignalP、ProtComp、Phyre、big-PI Fungal Predictor、SMART、TMHMM等生物信息學(xué)分析工具對上述序列開展蛋白質(zhì)亞細胞定位、細胞信號肽、二級結(jié)構(gòu)、錨定位點、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域等分析，同時，對上述序列開展了與炭疽菌屬不同真菌遺傳進化關(guān)系分析。

參考文獻：

[1]韓長志. 膠孢炭疽病菌的研究進展[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2012，27（增刊1）：386-389.

[2]韓長志. 膠孢炭疽菌侵染過程相關(guān)基因研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（9）：165-169.

[3]OConnell R J，Thon M R，Hacquard S，et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses[J]. Nature Genetics，2012，44（9）：1060-1065.

[4]韓長志. 膠孢炭疽菌RGS蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015（1）：116-122.

[5]賈 慧，孟慶江，李志勇，等. 玉米大斑病菌黑色素合成酶基因的全基因組定位及表達模式分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（14）：2767-2776.

[6]Widsten P，Kandelbauer A. Laccase applications in the forest products industry：a review[J]. Enzyme and Microbial Technology，2008，42（4）：293-307.

[7]陳 新. 稻瘟病菌兩個漆酶基因功能分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

[8]Sbaghi M，Jeandet P，Bessis R，et al. Degradation of stilbene‐type phytoalexins in relation to the pathogenicity of Botrytis cinerea to grapevines[J]. Plant Pathology，2010，45（1）：139-144.

[9]孟 川. 玉米大斑病菌StLAC2基因與黑色素合成及致病性關(guān)系研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[10]Caero D C，Roncero M I. Functional analyses of laccase genes from Fusarium oxysporum[J]. Phytopathology，2008，98（5）：509-518.

[11]Lin S Y，Okuda S，Ikeda K，et al. LAC2 encoding a secreted laccase is involved in appressorial melanization and conidial pigmentation in Colletotrichum orbiculare[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2012，25（12）：1552-1561.

[12]Tsuji G，F(xiàn)ujikawa J，Ishida H，et al. Laccase gene LAC1 of colletotrichum lagenarium is not essential for melanin biosynthesis and pathogenicity[J]. Journal of General Plant Pathology，2001，67（3）：182-190.

[13]韋運謝，張 賀，劉曉妹，等. 芒果膠孢炭疽菌漆酶lac1與致病力的相關(guān)性分析[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2016，36（11）：5-10.

[14]韋運謝，蒲金基，張 賀，等. 膠孢炭疽菌漆酶基因Lac2的序列特征與表達分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：35-38.

[15]李 婭，韓長志. 云南省核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策分析[J]. 經(jīng)濟林研究，2012，30（4）：162-167.

[16]曹志艷. 玉米大斑病菌黑色素合成途徑相關(guān)基因的克隆及功能分析[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[17]Emanuelsson O，Brunak S，von Heijne G，et al. Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP and related tools[J]. Nature Protocols，2007，2（4）：953-971.

[18]Dyrlv-Bendtsen J，Nielsen H，von Heijne G，et al. Improved prediction of signal peptides：SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology，2004，340（4）：783-795.

[19]Emanuelsson O，Nielsen H，Brunak S，et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology，2000，300（4）：1005-1016.

[20]Eisenhaber B，Schneider G，Wildpaner M，et al. A sensitive predictor for potential GPI lipid modification sites in fungal protein sequences and its application to genome-wide studies for Aspergillus nidulans，Candida albicans，Neurospora crassa，Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe[J]. Journal of Molecular Biology，2004，337（2）：243-253.

[21]Gasteiger E，Hoogland C，Gattiker A，et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[J]. The proteomics protocols handbook：Springer，2005：571-607.

[22]Schultz J，Milpetz F，Bork P，et al. SMART，a simple modular architecture research tool：identification of signaling domains[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（11）：5857-5864.

[23]Letunic I，Doerks T，Bork P. SMART 7：recent updates to the protein domain annotation resource[J]. Nucleic Acids Research，2012，40：D302-D305.

[24]Tusnady G E，Simon I. The HMMTOP transmembrane topology prediction server[J]. Bioinformatics，2001，17（9）：849-850.

[25]Kelley L A，Mezulis S，Yates C M，et al. The phyre2 web portal for protein modeling，prediction and analysis[J]. Nature Protocols，2015，10（6）：845-858.

[26]Thompson J D，Gibson T J，Higgins D G . Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.[J]. Curr Protoc Bioinformatics，2002，Chapter 2（Unit 2）：Unit 2.3.

[27]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[28]Kelley L A，Sternberg M J. Protein structure prediction on the Web：a case study using the Phyre server[J]. Nature Protocols，2009，4（3）：363-371.

[29]Buchan D W A，Minneci F，Nugent T C O，et al. Scalable web services for the PSIPRED Protein Analysis Workbench[J]. Nucleic Acids Research，2013，41（W1）：W349-W357.

[30]劉郵洲，陳夕軍，尹小樂，等. 23株芽胞桿菌及其脂肽類化合物抑菌活性比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，33（3）：533-542.

[31]柳志強，李喬曼，徐 爽，等. 催吐蘿芙木內(nèi)生菌Bacillus subtilis LYM3的抑菌活性產(chǎn)物[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，33（1）：67-72. 張玉佩，陸建飛. 江蘇省小麥生產(chǎn)的時序變化及比較優(yōu)勢分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（6）：52-57.