劉子記 劉維俠 朱婕

摘要：苦瓜MAP30蛋白屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤活性，并且具有良好的特異性，對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用。總結(jié)了MAP30蛋白結(jié)構(gòu)、抗病毒活性、抗腫瘤活性及相關(guān)機(jī)制，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步深入研究MAP30蛋白抗病毒、抗腫瘤機(jī)制及開發(fā)相關(guān)藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苦瓜;核糖體失活蛋白;MAP30;抗病毒;抗腫瘤;現(xiàn)狀;應(yīng)用前景

苦瓜（Momordica charantia L.）起源于非洲，屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（Momordica）藤蔓性1年生草本植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)[1-2]。據(jù)《本草綱目》記載，苦瓜“苦寒、無毒、除邪熱、解勞乏、清心明目、益氣壯陽”?？喙献鳛樗幨惩粗参?，一方面富含維生素C、維生素E及多種礦物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值很高;另一方面苦瓜所含的藥理活性成分具有抗腫瘤、消炎和增強(qiáng)人體免疫力等多種功效[3-5]。

核糖體失活蛋白（ribosome-inactivating proteins，RIPs）是一類主要存在于植物中具有RNA N-糖苷酶活性[6-7]、RNA水解酶活性[8]、DNA酶活性[9]的毒蛋白，RIPs通過作用于核糖體大亞基28S rRNA，破壞核糖體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[10-11]。RIPs包括3種類型[12-13]：Ⅰ型RIPs為單肽鏈堿性蛋白，分子量約為30 ku，Ⅱ型RIPs是由具有植物凝集素活性的B鏈和具有RNA N-糖苷酶活性的A鏈通過二硫鍵連接的雙鏈蛋白，分子量約為60 ku，Ⅱ型RIPs由具有RNA N-糖苷酶活性的N端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)未知功能的C端結(jié)構(gòu)域組成[14]。葫蘆科、石竹科（Caryophyllaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）和百合科（Liliaceae）植物中都含有豐富的RIPs[15]，其中苦瓜核糖體失活蛋白具有顯著的抗菌[16]、抗病毒[17]和抗腫瘤活性[18]，受到人們的廣泛關(guān)注。苦瓜中已發(fā)現(xiàn)的RIPs主要有α-苦瓜素、β-苦瓜素和MAP30蛋白（momordica anti-HIV protein of 30KD）等，均屬于I型RIPs。MAP30蛋白不但具有抗病毒[19]和抗腫瘤[20]等多種生物學(xué)活性，而且具有良好的特異性，只對(duì)病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞起作用，對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用，這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)顯示了巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值[21-22]。筆者總結(jié)了國內(nèi)外研究者對(duì)苦瓜MAP30蛋白結(jié)構(gòu)、抗病毒活性、抗腫瘤活性及相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步闡明MAP30蛋白抗病毒、抗腫瘤機(jī)制及開發(fā)相關(guān)藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 MAP30蛋白結(jié)構(gòu)

MAP30基因長(zhǎng)861 bp，不含內(nèi)含子，編碼286個(gè)氨基酸，包括N端23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽及由263個(gè)氨基酸組成的成熟MAP30蛋白，屬于分泌蛋白[19]。MAP30蛋白分子式為C1 468H2 306N372O423S4，相對(duì)分子量30 ku，理論等電點(diǎn)pI為9.08，負(fù)電荷殘基（天冬氨酸+谷氨酸）為24個(gè)，正電荷殘基（精氨酸+賴氨酸）為29個(gè)，屬于穩(wěn)定蛋白，51～53個(gè)位點(diǎn)天冬酰氨-亮氨酸-蘇氨酸殘基是N連接糖基化位點(diǎn)，MAP30蛋白雖不含半胱氨酸殘基，但是含有特定的色氨酸190和蛋氨酸254殘基[23]。MAP30 2級(jí)結(jié)構(gòu)中包括8個(gè)α-螺旋和9個(gè)β-折疊，其中N端富含β-折疊，C端富含α-螺旋，C端最后20個(gè)氨基酸殘基具有高度靈活性，不具常規(guī)2級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能在MAP30蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)中起過渡作用[24-25]。

2 MAP30蛋白抗病毒活性研究現(xiàn)狀及作用機(jī)制

MAP30蛋白以病毒感染細(xì)胞及病毒本身作為攻擊靶點(diǎn)，這就決定了MAP30蛋白抗病毒的廣譜性。除抗HIV（human immunodeficiency virus，HIV）外，其對(duì)單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）[26]、乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）[27]等均有明顯的抑制作用。

Lee-Huang等首次從苦瓜中分離純化了MAP30蛋白并對(duì)其藥理活性進(jìn)行了研究[19]，結(jié)果表明，MAP30不但抑制HIV初始感染，而且可抑制病毒顆粒釋放和病毒DNA在細(xì)胞間傳播。以H9細(xì)胞株作指示細(xì)胞，檢測(cè)核心抗原P24蛋白的表達(dá)和病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著MAP30濃度的提高，對(duì)P24表達(dá)的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度提高至 33.4 nmol/L 時(shí)，P24的表達(dá)受到完全抑制。MAP30對(duì)HIV反轉(zhuǎn)錄活性抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，當(dāng)MAP30濃度為0.334、3.34、33.4、334 nmol/L時(shí)，HIV的反轉(zhuǎn)錄活性減少到52%、25%、13%、6%，在同樣的試驗(yàn)條件下并未觀察到細(xì)胞毒副作用。該項(xiàng)研究表明，MAP30既可抑制感染過程，還可抑制病毒的復(fù)制與表達(dá)。Lee-Huang等研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)MAP30蛋白同樣具有抑制病毒整合酶和致使病毒DNA拓?fù)涫Щ罨钚訹23]。王臨旭等研究了MAP30、無環(huán)鳥苷（acyclic guanosine，ACV）對(duì)HSV的體外抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，MAP30和ACV均可減輕HSV致細(xì)胞病變效應(yīng)，并且MAP30的IC50抑制濃度明顯低于ACV[28]。另外相關(guān)研究表明，MAP30對(duì)ACV的耐藥株同樣具有明的顯抑制作用，其抗病毒活性比ACV高100倍甚至1 000倍[26]。王九平等以HBV DNA轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞株（HepG2.2.15）為靶細(xì)胞，探討了MAP30體外抗HBV的作用，研究結(jié)果表明MAP30能抑制共價(jià)環(huán)狀閉合DNA及HBV復(fù)制中間體，并未發(fā)現(xiàn)MAP30對(duì)細(xì)胞有毒副作用[29]。Fan等研究發(fā)現(xiàn)，MAP30蛋白能夠抑制HBV DNA的復(fù)制和乙肝表面抗原（hepatitis bs antigen，HBsAg）分泌，MAP30蛋白對(duì)HBV DNA、HBsAg和乙型肝炎E抗原（hepatitis be antigen，HBeAg）的抑制率存在顯著的劑量效應(yīng)，低劑量的MAP30蛋白（8 μg/mL）便可抑制HBsAg和HBeAg的表達(dá)[27]。王臨旭等證實(shí)了MAP30蛋白具有體外抗HBV的作用[30-31]。

目前認(rèn)為MAP30蛋白抗病毒的作用機(jī)制包括以下幾點(diǎn)：（1）選擇性進(jìn)入病毒感染細(xì)胞，發(fā)揮rRNA N-糖苷酶活性，作用于28S rRNA核苷酸殘基位點(diǎn)，即A4324或G4323，從而解開A4324或G4323位置核糖和嘌呤間的糖苷鍵，非特異性地使宿主細(xì)胞核糖體失活，從而干擾合成病毒復(fù)制所需要的酶及蛋白質(zhì)，抑制病毒復(fù)制，最終引起細(xì)胞死亡，病毒也被殺死[32]。（2）病毒基因的整合和表達(dá)須要具有拓?fù)浠钚越Y(jié)構(gòu)的DNA或RNA分子，MAP30蛋白能夠發(fā)揮DNA（RNA）糖苷酶/脫嘌呤裂解酶的活性，直接作用于病毒DNA、RNA分子，使超螺旋結(jié)構(gòu)變成缺口環(huán)狀或線狀的解螺旋狀態(tài)，致使拓?fù)涫Щ?，催化雙鏈斷裂，進(jìn)而使病毒喪失復(fù)制、轉(zhuǎn)錄功能，抑制其整合和表達(dá)[24，33]。（3）MAP30蛋白具有抑制整合酶的活性[34]。MAP30對(duì)整合酶催化的DNA 3′末端加工、鏈轉(zhuǎn)移和去整合3個(gè)步驟都有明顯抑制作用，通過3個(gè)方面的活性發(fā)揮抑制整合酶的作用。另外，MAP30蛋白可作用于HIV特異的DNA長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR），通過封閉LTR的U3和U5區(qū)使其成為整合酶的非適合底物，間接導(dǎo)致整合酶失活[33]。其中（2）和（3）是MAP30蛋白抗病毒的主要作用機(jī)制[19]。

3 MAP30蛋白抗腫瘤活性研究現(xiàn)狀及作用機(jī)制

相關(guān)研究指出，使用天然產(chǎn)物并結(jié)合合理膳食，可以降低腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前已報(bào)道的具有抗癌作用的天然活性物質(zhì)包括谷物、蔬菜以及部分傳統(tǒng)中藥材提取物。苦瓜在中國、印度和斯里蘭卡等國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中一直被用于治療多種疾病[35]。由于苦瓜MAP30蛋白抗腫瘤活性強(qiáng)、毒性低，已成為近年來抗癌研究的熱點(diǎn)。

Lee-Huang等研究證實(shí)，MAP30在體內(nèi)外都有抗人乳腺腫瘤的效果，乳腺癌細(xì)胞抗原HER2的表達(dá)受到顯著影響，采用MAP30處理腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231，腫瘤細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制[20]。李春陽等研究發(fā)現(xiàn)，MAP30對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901有明顯的抑制增殖作用，采用MAP30處理后的SGC7901細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)并使其DNA含量改變[36]。林育泉等研究發(fā)現(xiàn)，MAP30對(duì)小鼠S-180腫瘤細(xì)胞株較敏感，隨著處理濃度增加，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)[37]。Fan等研究證實(shí)，MAP30能有效抑制大腸癌LoVo細(xì)胞增殖，并存在時(shí)間和濃度的依賴性，凋亡蛋白Bax的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì)，抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì)[38]。樊劍鳴等研究表明，MAP30蛋白能夠誘發(fā)胃腺癌細(xì)胞MCG803的凋亡[39]，MAP30蛋白對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞體外生長(zhǎng)具有抑制作用[40]。韓曉紅等研究發(fā)現(xiàn)，MAP30蛋白可以誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞株EC-1.71凋亡[41]。鄧緬等研究證實(shí)，MAP30對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549增殖有明顯的抑制作用[42]。何義國等的研究結(jié)果顯示，MAP30蛋白對(duì)小鼠黑色素瘤、人宮頸癌細(xì)胞和人表皮癌細(xì)胞均表現(xiàn)出抑制作用[43]。邱華麗等研究結(jié)果表明，MAP30蛋白體外可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡[44]。

目前認(rèn)為MAP30蛋白抗腫瘤作用機(jī)制包括以下幾點(diǎn)：（1）抑制核糖體活性。MAP30作為RIP，具有N-糖苷酶活性，能使核糖體28S rRNA的A4324或G4323脫去1個(gè)A，導(dǎo)致核糖體失去活性，抑制腫瘤細(xì)胞蛋白合成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，也可作用于超螺旋DNA或RNA分子，使其松弛斷裂拓?fù)涫Щ?，影響腫瘤DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。（2）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Fan等研究表明，MAP30能夠誘導(dǎo)大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡[38]。Sun等利用基因芯片分析表明，MAP30通過上調(diào)與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[45]。（3）下調(diào)與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的基因。Sun等利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MAP30可有效下調(diào)一些在腫瘤細(xì)胞增殖和膨大中起作用的基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[45]。（4）抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性及表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。（5）調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的表達(dá)水平。（6）可致黏附分子CD54表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞黏附性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[46]。另外，MAP30誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡還涉及到下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，調(diào)控p53基因表達(dá)[47-48]。（7）MAP30蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，說明MAP30對(duì)這2種細(xì)胞存在不同的細(xì)胞信號(hào)途徑，因此對(duì)MAP30作用于腫瘤細(xì)胞的信號(hào)途徑仍須要進(jìn)一步研究。

4 MAP30蛋白應(yīng)用前景分析

病毒感染和惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的2類疾病。傳統(tǒng)的抗病毒、抗腫瘤類藥物主要是一些逆轉(zhuǎn)錄酶或蛋白酶抑制劑，不但生產(chǎn)成本高、價(jià)格昂貴，而且作用途徑單一，具有不能完全清除體內(nèi)病毒、廣譜性差、容易產(chǎn)生耐藥性、缺乏良好的特異性及嚴(yán)重的毒副作用等缺點(diǎn)。

從傳統(tǒng)中藥和植物資源中尋找新的抗病毒、抗腫瘤藥物是今后一個(gè)重要的發(fā)展方向。從葫蘆科（Cucurbitaceae）植物栝樓（trichosanthes kirilowii）的塊根中提取的天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）[49]、從絲瓜（Luffa cylindrica）種子中提取的絲瓜蛋白[50]以及從大戟科（Euphorbiaceae）多花白樹[Suregade glomerulata （BL.）]種子中提取的GAP31蛋白[51]等，都具有較好的抗病毒、抗腫瘤等活性。相關(guān)研究表明，MAP30蛋白具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤活性，具有比TCS更高效、安全的抗病毒活性[52]，MAP30蛋白對(duì)多種類型病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞非常有效，誘導(dǎo)其凋亡，而對(duì)未感染的正常細(xì)胞，包括T-細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、精子細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和胚胎細(xì)胞等均無毒性[53-54]，亦不產(chǎn)生耐藥性，克服了傳統(tǒng)抗病毒、抗腫瘤類藥物具有的缺點(diǎn)，是一種新型抗腫瘤、抗病毒候選藥物，具有良好的研究與應(yīng)用前景。

MAP30蛋白是一種非常有效的抗病毒、抗腫瘤植物成分，但苦瓜果實(shí)和種子中MAP30含量少且分離純化工藝步驟、效率不高，隨著基因工程和分子生物學(xué)研究的發(fā)展，利用基因工程方法生產(chǎn)MAP30重組蛋白將成為必然的發(fā)展方向，具有一定的優(yōu)勢(shì)。以往研究在MAP30蛋白的結(jié)構(gòu)、藥理作用和機(jī)理方面進(jìn)行了大量的試驗(yàn)。同時(shí)，也嘗試在不同生物中表達(dá)MAP30蛋白，以期得到具有良好藥用價(jià)值的生物活性蛋白。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在相應(yīng)的表達(dá)體系中對(duì)MAP30基因進(jìn)行了表達(dá)研究，獲得的重組MAP30蛋白同樣具有抗病毒、抗腫瘤和抗菌活性。Lee-Huang等采用原核生物表達(dá)MAP30蛋白，活性分析表明重組MAP30蛋白對(duì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、骨髓瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤均具有明顯抑制作用[23]。Arazi等研究證實(shí)，采用南瓜黃化病毒載體生產(chǎn)的重組MAP30蛋白同樣具有抗病毒、抗腫瘤活性[55]。

盡管MAP30基因已成功在原核生物中表達(dá)，但與天然的MAP30蛋白相比，其活性存在一定的差距。樊劍鳴等研究證實(shí)，采用畢赤酵母表達(dá)的重組MAP30蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，IC50為30 μg/mL[39]。而李春陽等提取的天然MAP30對(duì)胃癌細(xì)胞的IC50為 18 μg/mL[36]，進(jìn)一步說明重組MAP30比天然提取的蛋白活性稍低。而與林育泉等運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)的重組MAP30[37]相比，畢赤酵母表達(dá)的重組MAP30活性明顯偏高。因此在將來的研究中可以通過多渠道開展MAP30蛋白表達(dá)試驗(yàn)，探索最佳表達(dá)系統(tǒng)，并將其開發(fā)成為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類抗病毒、抗腫瘤新藥，用于臨床治療和日常保健，具有顯著的應(yīng)用前景，同時(shí)也可以為同類藥物蛋白的研發(fā)提供理論與試驗(yàn)基礎(chǔ)。另外，由于MAP30不同酶解片段具有不同的生物活性[56]，因此將具有相應(yīng)活性的片段構(gòu)建成具有導(dǎo)向殺傷力的藥物將是MAP30在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的一個(gè)嶄新方向。

MAP30蛋白能夠以病毒感染的細(xì)胞及病毒本身作為攻擊靶點(diǎn)，特異抑制受病毒感染的細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞，抑制效果在一定范圍內(nèi)具有劑量和時(shí)效依賴關(guān)系，但MAP30不能進(jìn)入正常細(xì)胞，不能誘導(dǎo)正常二倍體細(xì)胞凋亡，可能由于腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞對(duì)MAP30的通透性加大，這也許與細(xì)胞膜性質(zhì)變化有關(guān)，另外MAP30蛋白識(shí)別腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的具體機(jī)制尚待研究。MAP30對(duì)正常細(xì)胞毒性很小，這表明MAP30在病毒感染細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞與正常細(xì)胞之間發(fā)揮凋亡作用存在著不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、基因調(diào)控方式等。繼續(xù)深入研究MAP30蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，明確抗病毒、抗腫瘤作用機(jī)理，進(jìn)而開發(fā)新型抗病毒、抗腫瘤藥物制劑，必將產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

5 結(jié)語

苦瓜作為一種優(yōu)質(zhì)的藥食兼用的食品加工資源，無論在醫(yī)藥、保健食品、食品加工業(yè)等方面都有非常廣泛的應(yīng)用前景。MAP30蛋白主要針對(duì)底物保守區(qū)域發(fā)揮作用，通過多途徑、多層次發(fā)揮抗病毒和抗腫瘤功能，不易產(chǎn)生耐藥性，并且對(duì)耐藥性菌株也非常有效，具有高效、安全等特點(diǎn)，顯示出巨大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，備受各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注，隨著研究的進(jìn)一步深入，MAP30蛋白的應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊。伴隨經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，全民健康意識(shí)和保健意識(shí)逐步加強(qiáng)，苦瓜產(chǎn)業(yè)必將獲得更大的發(fā)展。

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