王玉俊+樊忠慧+王長(zhǎng)寶+岳麗紅

摘要：以6種白腐真菌作為供試菌株，5種食用菌作為對(duì)照菌株，采用愈創(chuàng)木酚及α-萘酚基質(zhì)平板顯色法，依據(jù)漆酶催化氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生顯色圈的直徑大小及變色程度對(duì)產(chǎn)漆酶菌株進(jìn)行初篩；并采用ABTS酶活力測(cè)定法對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果表明，11種真菌均具有分泌漆酶的能力，得到5株高產(chǎn)漆酶的白腐真菌菌株，由強(qiáng)至弱排列依次為朱紅栓菌[Trametes cinnabarina（Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄層孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、單色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]、輪紋韌革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]和寬鱗棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]，酶活力分別為23.47、20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。

關(guān)鍵詞：白腐真菌；漆酶；顯色直徑；酶活力

中圖分類號(hào)：Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）21-4043-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.21.012

Screening of White Rot Fungi with High Laccase Yield

WANG Yu-jun，F(xiàn)AN Zhong-hui，WANG Chang-bao，YUE Li-hong

（College of Life Science，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

Abstract： With 6 kinds white rot fungi as test strains and 5 kinds edible fungi as control strain，the method of plate substrate chromogenic of Guaiacol and α-naphthol were adopted，the diameter of chromogenic and the degree of discoloration were compared，the secrete laccase strains were screened preliminary. And strains were screened for the second time by the method of ABTS laccase activity determination. The results showed that all kinds of fungi had the ability to secrete laccase. 5 strains of high yield laccase white rot fungi were obtained，and the rank（from high to low） of these 5 kinds of fungi on the laccase activity were Trametes cinnabarina，Pyropolyporus fomentarius，Coriolus unicolor，Stereum ostrea and Favolus squamosus，enzyme activities were 23.47 U/mL，20.26 U/mL，19.52 U/mL，18.39 U/mL，17.93 U/mL，respectively.

Key words： white rot fungi； laccase； chromogenic diameter； enzyme activity

漆酶能夠體外催化O-和P-聯(lián)苯酚、多酚、芳香胺、苯硫醇和酚類染料等的氧化反應(yīng)，降解多環(huán)芳烴、木質(zhì)素能力較強(qiáng)，在紙漿生物漂白、廢水處理、苯氧基類除草劑去毒等領(lǐng)域具有廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值[1-5]。實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)的漆酶主要來(lái)源于白腐真菌，從白腐真菌中篩選出高產(chǎn)漆酶菌株對(duì)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的降解至關(guān)重要[6，7]。本試驗(yàn)以6種白腐真菌作為供試菌株，5種食用菌作對(duì)照菌株，選用愈創(chuàng)木酚及α-萘酚基質(zhì)為選擇性培養(yǎng)基，并通過(guò)ABTS酶活力測(cè)定試驗(yàn)，篩選出高產(chǎn)漆酶優(yōu)良菌株，為深入高產(chǎn)漆酶真菌的工業(yè)化開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 朱紅栓菌[Trametes cinnabarina （Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄層孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、寬鱗棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]、輪紋韌革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]、單色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]和平蓋靈芝[Ganoderma applanatum（Pers）Pat]，采集于黑龍江省涼水國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)；蟹味菇[Hypsizygus marmoreus （Peck） H.E.Bigelow]、平菇[Pleurotusostreatus（Jacq ex Fr.）Quel]、杏鮑菇[Pleurotus eryngii （DC.ex.Fr.）Quel]、金針菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing]和滑子蘑[Pholiota nameko （Ito ex Imai）]，超市購(gòu)買后純化分離。菌株均保存在佳木斯大學(xué)。

1.1.2 主要儀器 高壓蒸氣滅菌鍋（浙江新豐高壓滅菌鍋），303-1A培養(yǎng)箱（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司），DK-500水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。endprint

1.1.3 藥品 葡萄糖（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），愈創(chuàng)木酚（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），α-萘酚（上海展云化工有限公司），ABTS（酷爾化學(xué)科技有限公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂15 g，用去離子水定容至1 L；②液體發(fā)酵培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，用去離子水定容至1 L；③0.03%愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基。1 L PDA培養(yǎng)基中加入0.3 g愈創(chuàng)木酚；④α-萘酚-PDA培養(yǎng)基。1 L PDA培養(yǎng)基中加入0.3 g α-萘酚。分裝于200 mL錐形瓶中，121 ℃下高壓蒸氣滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株的初步篩選 用打孔器分別取1.0 cm生長(zhǎng)7 d的11種菌株接種于0.03%愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)7 d，菌落周圍呈紅褐色者為產(chǎn)酶陽(yáng)性菌株，記錄與培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)應(yīng)的顯色直徑；用打孔器分別取1.0 cm生長(zhǎng)7 d的11種菌株接種于α-萘酚-PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，菌落周圍呈藍(lán)色者為漆酶產(chǎn)生菌，記錄與培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)應(yīng)的顯色直徑。

1.2.2 高產(chǎn)酶白腐菌株的復(fù)篩 用打孔器分別取1.0 cm生長(zhǎng)5 d的11種菌株接種于100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d后，過(guò)濾培養(yǎng)基，棄去濾渣。取2 mL濾液，加入2 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 5.0）和2 mL濃度為0.5 mol/L的ABTS。35 ℃下應(yīng)用可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)420 nm波長(zhǎng)處吸收值的變化，10 s間隔讀數(shù)，記錄1 min內(nèi)吸收值的變化量，每種真菌進(jìn)行3次平行重復(fù)，并計(jì)算漆酶活力（公式1）。在一定條件下，1 min內(nèi)氧化1 μmol底物所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

E=■ （1）

式中，E為酶活力，單位為μmol/（L·min）即U/mL，A1、A2為吸光度值變化的兩個(gè)端值，t為吸光度值從A1至A2所經(jīng)歷的時(shí)間，K為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基顯色圈直徑比較

在其他條件一致的情況下，11種真菌在愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)7 d后，均有一定程度的顯色反應(yīng)，顯色圈呈紅色，說(shuō)明均具有分泌漆酶的能力，但顯色直徑及變色程度存在明顯差異（圖1）。顯色圈直徑大于5 cm的菌株有5個(gè)，由大到小排列依次為朱紅栓菌、木蹄層孔菌、寬鱗棱孔菌、輪紋韌革菌、單色云芝，其直徑分別為6.81、6.59、6.27、6.21、5.77 cm。

2.2 α-萘酚-PDA培養(yǎng)基顯色圈直徑比較

經(jīng)過(guò)7 d的培養(yǎng)，11種真菌菌落周圍均形成不同直徑的藍(lán)色透明圈，說(shuō)明均可分泌出漆酶（圖2）。顯色圈直徑較大的菌株（大于6 cm）有6個(gè)，由大到小排列依次為朱紅栓菌、木蹄層孔菌、平菇、輪紋韌革菌、單色云芝、寬鱗棱孔菌，其直徑分別為10.00、8.70、8.18、7.39、7.22、6.71 cm。

2.3 漆酶酶活力的比較

11種真菌均具有一定的分解ABTS的能力（圖3），漆酶活力最高的是朱紅栓菌，酶活力為23.47 U/mL，其次為木蹄層孔菌、輪紋韌革菌、單色云芝、寬鱗棱孔菌，酶活力依次為20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。以上5株白腐真菌產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)，而對(duì)照菌株產(chǎn)漆酶能力則相對(duì)較弱。

3 小結(jié)與討論

平皿顯色圈法是一種直觀、快速、靈敏的檢測(cè)漆酶活力的方法，一定程度上輔助了高產(chǎn)漆酶菌株的鑒別；漆酶可將ABTS分解為ABTS自由基，隨著ABTS自由基的增加，420 nm波長(zhǎng)處吸光值也逐漸增大，根據(jù)420 nm波長(zhǎng)處的紫外吸光值的檢測(cè)比較11種真菌所分泌漆酶的酶活力，ABTS漆酶酶活測(cè)定法靈敏度高，本試驗(yàn)采用ABTS法進(jìn)一步檢測(cè)真菌菌株產(chǎn)漆酶能力。朱紅栓菌、木蹄層孔菌、輪紋韌革菌、單色云芝和寬鱗棱孔菌在愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基和α-萘酚-PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)程中，生長(zhǎng)速度較快，顯色圈直徑較大，變色程度明顯，性狀比較穩(wěn)定，它們產(chǎn)漆酶的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他菌株，分解ABTS速度較快。這5種白腐真菌分泌漆酶的酶活力均高于17.0 U/mL，其中，篩選的朱紅栓菌漆酶活力達(dá)23.47 U/mL，有研究報(bào)道[8]篩選的木腐菌株最高產(chǎn)漆酶能力為20.3 U/mL，朱紅栓菌產(chǎn)漆酶的能力高出前人報(bào)道菌株的15.6%。說(shuō)明這5種白腐真菌產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)，在工業(yè)化應(yīng)用方面，可作為高產(chǎn)漆酶菌株進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，為今后高產(chǎn)漆酶真菌誘變育種及工程菌株的深入研究提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 秦文娟，余惠生，付時(shí)雨.利用漆酶降解有機(jī)污染物[J].中國(guó)造紙，2001，20（5）：58-62.

[2] 雷德柱，龍嘉欣，田長(zhǎng)恩.產(chǎn)漆酶的草菇菌株的篩選[J].工業(yè)微生物，2008，38（3）：51-55.

[3] DUR？魣N N，ROSA M A，DANNIBALE A，et al. Applications of laccases and tyrosinases（phenoloxidases） immobilized on different supports：A review[J].Enzyme & Microbial Technology，2002， 31（7）：907-931.

[4] HOFRICHTER M，SCHEIBNER K S I，F(xiàn)RITSCHE W. Enzymatic combustion of aromatic and aliphatic compounds by manganese peroxidase from Nematoloma frowardii[J].Applied & Environmental Microbiology，1998，64（64）：399-404.

[5] 靳 蓉，張飛龍.漆酶的來(lái)源與分離純化技術(shù)[J].中國(guó)生漆，2012， 31（3）：7-14.

[6] 單麗君，鄭曉冬.漆酶在食品工業(yè)的應(yīng)用進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2004，25（S1）：188-192.

[7] 劉卉娟，敖新宇，洪海迪，等.20株木腐菌高產(chǎn)漆酶菌株的篩選[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（12）：2858-2862.

[8] 李 松，劉 宇，湯文晶，等.1株真菌漆酶高產(chǎn)菌株的篩選及其漆酶的純化和性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（9）：45-50.endprint