蔡 華，王方平，余 意，趙維萍

小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物，近年種植面積逐漸擴(kuò)大。但部分小麥品種的抗凍性較差，加上某些人為與自然因素（如搶墑、早播等），以及冬春季災(zāi)害性天氣頻繁出現(xiàn)，低溫凍害對小麥生產(chǎn)的影響越來越大，已成為影響小麥生產(chǎn)最主要的災(zāi)害之一［1］。

抗凍基因是一種誘發(fā)基因，只有在特定條件（主要是低溫和短日照）的作用下，才能啟動其表達(dá)［2］。在抗凍基因表達(dá)前，植物的抗凍能力僅僅是一種潛能或基礎(chǔ)［3］。近年來，隨著對植物抗凍機(jī)理研究的不斷深入，以及分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物抗凍性研究，利用基因克隆技術(shù)提高作物的抗凍性也取得了突破性進(jìn)展［4］。在植物的凍害機(jī)理研究上，許多研究表明超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）等酶活性的高低與植物抗凍性密切相關(guān)［5－10］，其中，SOD被普遍認(rèn)為是一類重要的抗凍因子。SOD是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類，是生物體內(nèi)超氧陰離子的清除劑。低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，膜系統(tǒng)穩(wěn)定性受到影響，活性氧積累，使膜脂發(fā)生過氧化和脫脂作用，從而破壞膜結(jié)構(gòu)，而SOD可清除活性氧，維護(hù)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性［11］。此外，SOD在植物抗低溫、干旱等逆境方面也有重要作用［12－15］。國內(nèi)有關(guān)小麥 SOD的研究，大多集中于生產(chǎn)應(yīng)用［16］。本研究選取安徽省近年推廣的生態(tài)類型不同的8個小麥品種，抽穗前在實驗室模擬自然凍害條件進(jìn)行脅迫處理，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄后克隆sod基因，再進(jìn)行半定量研究，分析不同生態(tài)類型小麥品種sod基因表達(dá)狀況，并與未經(jīng)凍害脅迫處理的小麥進(jìn)行比較，分析sod基因?qū)π←溈箖龅淖饔茫樾←溈箖鰴C(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

試驗選用煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號、中國春、揚(yáng)麥15、煤生P2－1和鄭麥9023等8個安徽省推廣小麥品種，精選后于10月下旬播于裝有表土施足基肥的盆缽中，每盆10株，連盆埋于滁州學(xué)院小麥試驗基地，盆口與地面平齊，其他田間管理參照大田，試驗材料田間生長情況見圖1。

圖1 小麥田間盆栽

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫脅迫處理

于次年3月份，從田間連盆挖出已拔節(jié)的小麥苗，分成實驗和對照兩組，放入恒溫培養(yǎng)箱處理。實驗組先后設(shè)置如下處理：25℃處理24h，10℃處理12h；5℃處理12h；－1℃處理24h。期間按白天給光，夜間不給光。在－1℃處理期間，間隔6小時左右觀察一次，如發(fā)現(xiàn)有明顯葉片凍壞，即剪尚未凍傷的余葉，放入－80℃或液氮保存，留待抽提RNA用。對照組一直放在25℃處理72h。兩組小麥處理完成后，均剪取適量的葉片放入超低溫冰箱保存，留待抽提RNA用。

1.2.2 sod基因的克隆

取0.5g葉片樣品置于液氮中，研磨至粉末狀，用RNAiso Plus（TaKaRa公司）提取總RNA，并參照TIANScript RT Kit（TIANGEN 公司）操作步驟合成cDNA；根據(jù)GenBank中已有sod序列（AF092524），利用Primer 5.0軟件設(shè)計克隆小麥sod基因的引物SOD（表1）。再以上述cDNA為模板，以上述SOD引物為引物，配制10μL PCR體系，選取同上的PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段利用AXYGEN生物技術(shù)（杭州）有限公司提供的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化。將純化后的目的DNA樣品連接到TaKaRa公司提供的pMDTM18－T上，TA克隆后送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序鑒定。

表1 擴(kuò)增抗凍基因及內(nèi)參基因所用的引物

1.2.3 sod基因表達(dá)水平的檢測

用Tubulin（小麥微管蛋白）基因作為內(nèi)參，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使不同的樣品所擴(kuò)增Tubulin的電泳條帶亮度一致，進(jìn)一步確定所需單鏈cDNA的模板量，然后進(jìn)行各樣品的sod基因的半定量實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種小麥對凍害處理的反應(yīng)

凍害脅迫處理完全后，對本試驗在實驗室中模擬自然變溫處理的8個不同小麥品種進(jìn)行受凍情況調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一時期播種的相同時間進(jìn)行凍害處理的8個不同小麥品種中，揚(yáng)麥15凍死株高達(dá)12株，鄭麥9023凍死株10株，中國春凍死株9株，淮麥30凍死株有10株，濟(jì)麥22凍死株3株，煤生P2－1凍死株和5株，皖農(nóng)墾凍死株有3株，而煙農(nóng)19未觀察到凍死株，僅葉尖受凍枯死（見表2）。這恰好與小麥的春化類型基本相關(guān)，小麥春化類型分為春性、弱春性、半冬性、冬性小麥。在本實驗中，春性小麥有揚(yáng)麥15；弱春性小麥有鄭麥9023、淮麥30和中國春；半冬性小麥有濟(jì)麥22、煤生P2－1和皖農(nóng)墾2號；冬性小麥有煙農(nóng)19。

表2 8個不同品種小麥凍害處理后幼穗凍死狀態(tài)及凍害程度

2.2 sod基因cDNA片段的克隆

提取小麥的總RNA凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

（1、2、3、4、5、6、7、8分別為實驗組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號、中國春、揚(yáng)麥15、煤生P2－1、鄭麥9023小麥葉片 RNA 條帶，a、b、c、d、e、f、g、h分別為對照組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號、中國春、揚(yáng)麥15、煤生P2－1、鄭麥9023小麥葉片RNA條帶，M為Trans 2KMarker）

利用表1中SOD引物，從小麥葉片內(nèi)擴(kuò)增到預(yù)期的sod基因cDNA片段（見圖2）。

圖2 小麥葉片RNA提取凝膠電泳結(jié)果圖

圖3 SOD引物PCR凝膠電泳結(jié)果圖

（1、2、3、4、5、6、7、8分別為實驗組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號、中國春、揚(yáng)麥15、煤生P2－1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶，a、b、c、d、e、f、g、h分別為對照組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號、中國春、揚(yáng)麥15、煤生P2－1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶，M為Trans 2KMarker）

測序后經(jīng)同源性比較顯示，擴(kuò)增的片段與已報道相關(guān)基因同源性均在90%以上，表明擴(kuò)增的片段準(zhǔn)確無誤，可用于以下半定量PCR比較試驗。

2.3 凍害處理前后sod基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化

（1、2、3、4、5、6、7、8分別為實驗組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號、中國春、揚(yáng)麥15、煤生P2－1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶，a、b、c、d、e、f、g、h分別為對照組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號、中國春、揚(yáng)麥15、煤生P2－1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶，M為Trans 2KMarker）

由圖4可見，經(jīng)過凍脅迫后，各處理葉片內(nèi)sod轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量幾乎沒有多大的變化。弱春性、半冬性和冬性中各小麥品種之間相比，小麥植株葉片內(nèi)sod基因在凍脅迫期間表達(dá)量基本一致，然而本實驗中的春性小麥揚(yáng)麥15的對照組比實驗組轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量低。

圖4 SOD引物半定量PCR凝膠電泳圖

3 討論

在本實驗的8個小麥中，揚(yáng)麥15春性強(qiáng)，煙農(nóng)19為冬性小麥，而鄭麥9023、淮麥30和中國春皆為弱春性小麥，濟(jì)麥22、煤生P2－1和皖農(nóng)墾2號都是半冬性小麥。在凍害處理之后，揚(yáng)麥15的凍死率最高，與其抗凍類型表現(xiàn)一致。而其他小麥品種沒有明顯差異，因此，可以初步得出推論：凍害脅迫后，春性小麥的sod基因轉(zhuǎn)錄水平會明顯升高。

春性小麥、弱春性小麥和半冬性小麥在凍害處理后期，小麥植株的抗凍性顯著下降，因而植株凍害比較嚴(yán)重甚至凍死。而冬性小麥煙農(nóng)19在凍害處理后期抗凍性下降速率較為遲緩，所以植株未受凍害，僅一部分葉片枯死。在此次凍害處理中，春性小麥揚(yáng)麥15凍死率最高，抗凍性下降速率最快，而凍害處理后的揚(yáng)麥15的sod基因表達(dá)量明顯下降。這與預(yù)期的實驗結(jié)果基本一致。

植物的抗凍性是由很多個基因調(diào)控的數(shù)量性狀，已有研究表明sod基因的表達(dá)與植物的抗凍性密切相關(guān)。但是這些物質(zhì)在不同的植物中就會表現(xiàn)出不同的抗凍效果。Gabriela等［19］的研究表明sod參與了玉米的抗凍過程，而張燕等［6］認(rèn)為sod可能沒有參與Ca2＋誘導(dǎo)的煙草的抗凍過程。

本次實驗的結(jié)果表明，未經(jīng)低溫誘導(dǎo)，春性小麥植株葉片內(nèi)sod基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量明顯比其他春化類型的小麥植株要低，而經(jīng)過低溫誘導(dǎo)后，春性小麥植株葉片內(nèi)的sod基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量顯著升高，這與植株間的抗凍基因的性質(zhì)基本一致，而酶的活性也顯示的相似的結(jié)果［5，20］。因此，可以推測sod參與了小麥植株的抗凍過程，可以作為小麥植株抗凍性的鑒定指標(biāo)。本文還發(fā)現(xiàn)弱春性、半冬性和冬性小麥不管是否進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，這些類型的小麥葉片中的sod基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量都無明顯的變化，進(jìn)而可以推測sod基因雖然參與了小麥植株的抗凍過程，但是可能不是小麥抗凍性的唯一的鑒定指標(biāo)。

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