劉德賢扥

x[摘要] 目的 建立咳喘顆粒的HPLC指紋圖譜方法，為科學(xué)地評(píng)價(jià)咳喘顆粒的質(zhì)量提供依據(jù)。 方法 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，流速1.0 ml/min，柱溫：30℃。 結(jié)果 確定了16個(gè)共有峰，10批咳喘顆粒指紋圖譜的相似度均>0.96。 結(jié)論 建立了分離效果好、簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的方法，可用于咳喘顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法。

[關(guān)鍵詞] 咳喘顆粒；高效液相色譜；指紋圖譜；相似度

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）02（a）-0008-04

Study on HPLC fingerprint of Kechuan granules

LIU De-xian1，2 TAO Zun-wei2 ZHANG Ting2 ZHANG Yan2

1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300073，China；2.Tianjin Institute of Medical Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China

[Abstract] Objective To establish HPLC fingerprint of Kechuan granules for the quality control of its scientifically.Methods Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm）；acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution was used as the mobile phase for the gradient elution；the wavelength was set at 237 nm；the mobile phase at 30℃；the velocity of 1.0 ml/min to record the HPLC chromatograms of ten batches of samples. Results Sixteen common peaks were confirmed and similarity of 10 batches of Kechuan granules was more than 0.96. Conclusion The established method is sensitive，accurate and simple，and it can be used specifically for the quality control of Kechuan granules.

[Key words] Kechuan granules；HPLC；Fingerprint；Similarity

咳喘顆粒為院內(nèi)制劑，由五味子、白芍、甘草、黃芩等14味中藥組成，具有解表散寒、溫肺化飲之功效，治療咳嗽、哮喘效果顯著，未見(jiàn)相關(guān)的指紋圖譜報(bào)道。中藥復(fù)方作用特點(diǎn)相輔相成，即多成分、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的綜合效應(yīng)[1-3]，因此用單一指標(biāo)成分往往不能達(dá)到全面評(píng)價(jià)和控制復(fù)方制劑質(zhì)量的效果，而指紋圖譜由于其具有多指標(biāo)全面分析的作用[4-5]，已成為評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的有效方法，并被廣泛用于中藥及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究[6-10]。因此，為了更好地控制咳喘顆粒質(zhì)量，為臨床用藥提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法[11-12]建立咳喘顆粒的化學(xué)指紋圖譜，著重表達(dá)藥材的信息。對(duì)咳喘顆粒指紋圖譜中主要指紋峰進(jìn)行歸屬，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)、多角度控制咳喘顆粒質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT日本島津公司），PDA檢測(cè)器；超聲儀（KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（ABS135-S，瑞士梅特勒-托利多公司）；電子天平（JJ200，常熟雙杰測(cè)試儀器廠 ）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：1110736-200934，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：11610-201106）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-201117）、甘草酸銨對(duì)照品（110731-200615）、五味子醇甲對(duì)照品（110857-201211），以上五種對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；乙腈（色譜純，迪馬科技有限公司），甲醇（色譜純，迪馬科技有限公司），甲醇（分析純，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），乙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），娃哈哈純凈水（天津娃哈哈宏振飲料有限公司），咳喘顆粒（批號(hào)：tl20140507001～tl20140507010，醫(yī)內(nèi)制劑）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～30%A；30～50 min，30%～50%A；50～90 min，50%～90%A；90～100 min，90%～100%A；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，流速1.0 ml/min，分析時(shí)間75 min，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、甘草酸銨、五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.04、0.085、0.18 mg/ml的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取咳喘顆粒約5.0 g，置50 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，回流提取60 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取供試品（tl20140507001）和對(duì)照品溶液進(jìn)樣，記錄237 nm波長(zhǎng)下色譜圖。對(duì)保留時(shí)間和紫外光譜圖進(jìn)行對(duì)比可知6、7、10、15、16號(hào)峰分別是芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、甘草酸銨、五味子醇甲。10號(hào)峰（黃芩苷）10批供試品均有，峰型好，峰位適中，與相鄰峰分離良好。因此作為參照物峰，如圖1、圖2。在此條件下，理論塔板數(shù)以黃芩苷計(jì)算>2500。

圖1 批號(hào)（tl20140507001）樣品HPLC色譜圖

圖2 對(duì)照品HPLC色譜圖

6.芍藥苷；7.甘草苷；10.黃芩苷；15.甘草酸銨；16.五味子醇甲

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密取樣品（tl20140507001）溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.03%～0.51%，相對(duì)峰面積的RSD為1.24%～2.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密取樣品（tl20140507001）溶液，分別于0、4、8、16、24、48 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以10號(hào)峰（黃芩苷）為參照峰，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.46%，相對(duì)峰面積的RSD為0.78%～2.12%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（tl20140507001）溶液，精密稱取5份，按照“2.3”下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以10號(hào)峰（黃芩苷）為參照峰，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.03%～0.37%，相對(duì)峰面積的RSD為1.05%～2.47%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 標(biāo)定共有峰

對(duì)10批咳喘顆粒進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，以共有率100%記，共有16個(gè)共有峰，10批咳喘顆粒HPLC圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間除11號(hào)（1.5189）、13號(hào)（1.7136）、14號(hào)（2.6392），其余均<1.0，符合指紋圖譜要求，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.7 建立指紋圖譜共有模式

將10批咳喘顆粒HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版），以S5為參照，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜和共有模式圖譜，如圖3。

2.8 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版）對(duì)上述10批咳喘顆粒樣品進(jìn)行特征圖譜相似度計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，10批咳喘顆粒相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均>0.96，直觀說(shuō)明各批次咳喘顆粒之間無(wú)明顯差異性，本方法可用于鑒別咳喘顆粒的整體質(zhì)量。

3 討論

3.1 指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

考察了咳喘顆粒主要成分，參照相關(guān)文獻(xiàn)[13-21]，分別對(duì)210、237、250、294 nm進(jìn)行篩選。210、290 nm出峰較少，且出峰時(shí)間較晚。250 nm出峰較多，但是基線漂移。237 nm時(shí)出峰多、分離度好、基線平，因此選237 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)等度洗脫與梯度洗脫進(jìn)行選擇，結(jié)果等度洗脫分離度不如梯度洗脫好，因此選擇梯度洗脫。其次，對(duì)甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水四種流動(dòng)相進(jìn)行選擇，結(jié)果甲醇-磷酸、乙腈-磷酸峰型較甲醇-水、乙腈-水好，且基線平，乙腈-磷酸較甲醇-磷酸出峰多。因此，流動(dòng)相選擇乙腈-磷酸梯度洗脫。

3.3 提取條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)不同提取方法（超聲提取方法和加熱回流提取方法）進(jìn)行選擇，結(jié)果回流提取較超聲提取出峰多且峰型好，因此選擇回流提取。其次對(duì)提取溶劑進(jìn)行選擇，樣品分別加50 ml 25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇、75%乙醇、純甲醇、純乙醇溶液加熱回流提取，結(jié)果50%甲醇提取出峰最完全，分離度最好，所以選擇50%甲醇提取。最后考察提取時(shí)間，分別用50%甲醇回流提取15、30、45、60 min，結(jié)果超聲30 min，樣品出峰最完全，所以選擇30 min。因此，最終提取條件為50%甲醇回流提取30 min。

3.4 參照峰的確定

通過(guò)比較對(duì)照發(fā)現(xiàn)，6號(hào)峰是芍藥苷對(duì)照品峰，為咳喘顆粒白芍的主成分峰，峰面積大，但由于有拖尾現(xiàn)象；7號(hào)基線不平且分離度不好；15、16號(hào)峰峰型較小；因此6、7、15、16均不宜作參照峰；而10號(hào)峰峰面積較大，出峰時(shí)間較穩(wěn)定，基線較平，因此選作參照峰。

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（收稿日期：2014-11-03 本文編輯：郭靜娟）