劉 穎，張 璐，竇博鑫，關(guān)天琪，王 秋，石彥國(guó)，KALENIK Tatyana K

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076;2.俄羅斯遠(yuǎn)東聯(lián)邦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，海參崴690091)

乙醇的大量攝入會(huì)使肝臟受到不同程度的損傷，隨著人民生活水平的提高，酒精性肝病已經(jīng)成為繼病毒性肝炎后的另外一種多發(fā)的肝損傷疾病[1].但目前對(duì)于酒精性肝損傷的治療并不是十分理想，尚沒(méi)有一種高效的方法可以減輕飲酒帶來(lái)的肝損傷.白藜蘆醇是一種廣泛存在于自然界多種植物中的多酚類(lèi)化合物，化學(xué)名為 3，5，4'－三羥基 －1，2 － 二苯乙烯(3，5，4'－trihydroxystilbene)，分子式C14H12O3，具有抗氧化、降低血脂、抗血小板聚集、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高免疫功能等生理活性，已成為人們研究的熱點(diǎn)[2－4].近年來(lái)研究表明，白藜蘆醇可能有治療酒精性肝損傷的作用[5－6].本實(shí)驗(yàn)研究以酒精性肝損傷大鼠為模型，觀察白藜蘆醇對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，為酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑

白藜蘆醇購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，純度為98%;玉泉白酒購(gòu)自黑龍江省玉泉酒業(yè)有限責(zé)任公司，40%酒精度;護(hù)肝片購(gòu)自人民同泰藥店，哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠72只，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，體重180～220 g，無(wú)特定病原體(SPF級(jí))，許可證號(hào):SCXK(吉)－2011－0004.大鼠飼料購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司.適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，給與正常飲食.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SY－2－4電熱恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器代表有限公司;DHG－9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海恒科學(xué)儀器有限公司;BS224S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;TDL－5－A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;恒溫箱上海一恒科技有限公司;Mindray MR－96A酶標(biāo)儀 邁瑞公司;粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;eppendorf移液槍;722E分光光度計(jì)等.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 飼養(yǎng)環(huán)境

溫度20～25℃左右，自然光照，讓動(dòng)物自由飲食和飲水.適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將72只大鼠隨機(jī)分為6組，每組12只.空白對(duì)照組按照1 mL/100 g灌胃0.9%生理鹽水，8g/kg/d.白藜蘆醇低、中、高劑量組分別給予25、50、100 mg/kg劑量的白藜蘆醇+40%酒精8 g/kg/d溶液.模型對(duì)照組給予40%酒精8 g/kg/d.陽(yáng)性對(duì)照組40%酒精8 g/kg/d+治療酒精性肝損傷的藥物(護(hù)肝片4 g/kg).喂養(yǎng)期間，進(jìn)食進(jìn)水不限，共30 d，每周稱(chēng)2次體重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃劑量.

2.2 血清指標(biāo)測(cè)定

連續(xù)灌胃30 d，各組大鼠于30 d末次灌胃給藥后，禁食不禁水12 h，對(duì)各組動(dòng)物稱(chēng)重，眼球取血，3 500 r/min離心10 min分離血清，并予以編號(hào)，保存?zhèn)溆?

2.3 臟器指數(shù)的測(cè)定

采血后，斷頭處死動(dòng)物，立即取出大鼠肝臟、腎臟、脾臟，4℃生理鹽水洗凈，濾紙吸干表面水分后稱(chēng)其濕重，計(jì)算:肝指數(shù)(%)=肝臟濕重(g)/大鼠體重(g)×100%;腎指數(shù)(%)=腎臟濕重(g)/大鼠體重(g)×100%;脾指數(shù)(%)=脾臟濕重(g)/大鼠體重(g)×100%

2.4 觀察內(nèi)容

在動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程中，觀察大鼠的精神狀態(tài)、肢體活動(dòng)情況、體毛的光澤度、食欲、大便情況等.

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析(one－way ANOVA)，方差齊性時(shí)各組之間多重比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，P ＜0.05表明有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠活動(dòng)情況

實(shí)驗(yàn)期間模型組大鼠毛發(fā)光澤度較差(特別是灌胃剛結(jié)束后，毛發(fā)光澤度異常差，大鼠身體發(fā)軟)，體重增長(zhǎng)較慢，多數(shù)大鼠食欲差、不活躍、嗜睡、行動(dòng)遲緩、大便溏瀉等現(xiàn)象.白藜蘆醇高中低劑量組和藥物組則有明顯的改善.空白對(duì)照組大鼠則精神狀態(tài)很好，毛發(fā)有光澤，無(wú)嗜睡現(xiàn)象，食欲佳，大便正常.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，白藜蘆醇高劑量組和低劑量組共死亡2只大鼠，原因是由于灌胃時(shí)操作不當(dāng)，灌胃時(shí)將藥物誤灌入氣管.

3.2 肝臟組織大體觀察

模型組大鼠肝臟質(zhì)地較硬，表面粗糙，較脆易碎，色澤度較暗淡.有5只大鼠肝臟被膜與相鄰近組織有輕度的粘連.空白對(duì)照組大鼠肝臟表面光滑，顏色呈紅褐色，質(zhì)地中等.

3.3 白藜蘆醇對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝臟、腎臟、脾臟指數(shù)的影響

見(jiàn)表1.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱(chēng)取大鼠體重，各組間體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).由表1可以看出模型組的大鼠肝指數(shù)明顯升高，與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05);與模型組比較，白藜蘆醇高、中劑量組能降低大鼠肝指數(shù)(P＜0.05).而白藜蘆醇對(duì)大鼠腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05).

表1 各組大鼠肝指數(shù)、腎指數(shù)、脾指數(shù)的比較

3.4 白藜蘆醇對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清中ALT、AST水平的影響

由表2可以看出，模型組大鼠 ALT、AST、TG水平明顯升高，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，提示造模成功.白藜蘆醇三個(gè)劑量組均能顯著降低ALT、AST、TG的水平，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.01)，呈計(jì)量相關(guān)性.

表2 白藜蘆醇對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST的影響

3.5 白藜蘆醇對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清中SOD、MDA水平的影響

由表3可以看出，模型組的大鼠SOD水平明顯降低，MDA含量明顯升高，與正常組比較有顯著性差異(P＜0.01).與模型組比較，白藜蘆醇三個(gè)劑量組均能降低MDA含量(P＜0.01)，呈計(jì)量相關(guān)性;而與模型組比較，白藜蘆醇高、中劑量組能明顯升高SOD水平(P＜0.01)，差異具有顯著性.

表3 白藜蘆醇對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清SOD、MDA的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組的大鼠肝指數(shù)明顯升高，與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05).白藜蘆醇各劑量組均能顯著降低血清ALT、AST、TG活性，說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷有保護(hù)作用.同時(shí)，白藜蘆醇各劑量組也能顯著提高大鼠肝組織中抗氧化酶SOD的活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量，說(shuō)明白藜蘆醇的保護(hù)作用可能與增強(qiáng)機(jī)體清除自由基，防止脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān).

4 討論

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是因長(zhǎng)期、大量飲用各種含乙醇的飲料所致的肝臟損害性病變.近年來(lái)，我國(guó)ALD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[7].因此，開(kāi)發(fā)并篩選對(duì)ALD有確切防治作用的藥物并應(yīng)用于臨床，是當(dāng)前面臨的重要課題.

乙醇在其代謝過(guò)程中可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生大量自由基，能與細(xì)胞大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝細(xì)胞，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，大量肝內(nèi)酶(ALT、AST)釋放入血，并加速清除自由基酶(SOD)的耗竭，肝功能異常，脂質(zhì)代謝紊亂[8－10].酒精吸收入血后主要在肝臟代謝，酒精引起肝臟損害的機(jī)制涉及乙醇的直接毒性、乙醛的化學(xué)性損傷、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化等多個(gè)方面，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及肝功能異常[11]，其中氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化可能是酒精引起肝損傷的重要因素之一.在氧化和抗氧化體系中，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的最終代謝產(chǎn)物，其含量的高低可反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而反映細(xì)胞損傷的程度[12].而SOD是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用的酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要成分[13]，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo).

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白藜蘆醇各劑量組均能顯著降低血清ALT、AST的活性，說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷有保護(hù)作用.同時(shí)，白藜蘆醇各劑量組也能顯著提高大鼠肝組織中抗氧化酶SOD的活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量，說(shuō)明白藜蘆醇的保護(hù)作用可能與增強(qiáng)機(jī)體清除自由基，防止脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān).

綜上所述，白藜蘆醇可以降低血清ALT、AST活性和MDA的含量，提高SOD的含量，對(duì)酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用.白藜蘆醇減輕酒精對(duì)肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性，有效減輕了酒精對(duì)肝組織的損傷，其作用機(jī)制可能與其減輕肝臟炎癥、清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用等有關(guān).實(shí)驗(yàn)為白藜蘆醇在解酒保健領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用方面提供了依據(jù).

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