秦宇等

[摘要] 目的 探討microRNA let-7a靶向調(diào)控Caspase家族的機(jī)制及其在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病過程中的作用。方法 收集2014年7～9月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院（以下簡稱“我院”）眼科診斷為年齡相關(guān)性白內(nèi)障（排除其他眼部疾病）的患者晶狀體前囊膜標(biāo)本30例，作為實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)收集我院眼科眼庫提供的新鮮人眼透明晶狀體前囊膜標(biāo)本15例，作為對照組。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測let-7a可能調(diào)控的Caspase家族中的關(guān)鍵基因；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time q-PCR）檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組let-7a及其預(yù)測靶基因的表達(dá)；利用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染let-7a mimic和inhibitor，調(diào)節(jié)人晶狀體上皮細(xì)胞中l(wèi)et-7a的表達(dá)，利用Real time q-PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，并檢測預(yù)測靶基因的表達(dá)變化。 結(jié)果 3種不同的生物信息學(xué)軟件預(yù)測到Caspase家族中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9可能為let-7a的靶基因。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組let-7a的表達(dá)顯著降低，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)顯著升高。let-7a mimic轉(zhuǎn)染組，let-7a的表達(dá)顯著升高，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)顯著降低；let-7a inhibitor轉(zhuǎn)染組，let-7a的表達(dá)顯著降低，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)顯著升高；差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 let-7a可能通過靶向調(diào)控Caspase家族成員Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)，在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，let-7a可能成為白內(nèi)障非手術(shù)治療的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 微小RNA；let-7a；Caspase家族；白內(nèi)障

[中圖分類號] R776.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（b）-0004-06

Research of microRNA let-7a targeted Caspase family in the pathogenesis of cataract

QIN Yu1 ZHANG Jinsong1 MIN Xiaojie1 LUO Wenting2 LI Jing1 ZHAO Jiangyue1

1.Department of Ophthalmology， the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University Eye Hospital of China Medical University Key Lens Research Laboratory of Liaoning Province， China， Liaoning Province， Shenyang 110005， China； 2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation， Shengjing Hospital， China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110004， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of microRNA let-7a targeted Caspase family in the pathogenesis of age-related cataract. Methods 30 fresh specimens of anterior lens capsule of age-related cataract were obtained as experimental group from cataract patients with no other eye diseases during phacoemulsification at the Department of Ophthalmology， the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University（“our hospital” for short） form July to September 2014. 15 normal anterior lens capsule specimens were obtained as control group from eye bank of Department of Ophthalmology in our hospital. Biological information softwares were used to predict potential target genes of let-7a in Caspase family. Real time q-PCR was used to measure the expression of let-7a and potential target genes between the experimental group and the control group. Let-7a mimic and inhibitor were transfected into SRA01/04 cells using Lipofectamine 2000 to regulate the expression of let-7a， and then real time q-PCR was used to assess transfection efficiency and the expression of potential target genes. Results Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 were predicted as the potential target genes of let-7a using three different biological information softwares. Compared with control group， the expression of let-7a was significantly lower in the experimental group. On the contrary， the expression of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 increased in the same tissue specimens. The relative expression of let-7a in lens epithelial cells transfected with let-7a mimic increased， whereas decreased in cells transfected with let-7a inhibitor. The expression of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 transfected with let-7a mimic were reduced， while increased in let-7a inhibitor group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Let-7a may play a critical role in the pathogenesis of age-related cataract by targeting caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 in Caspase family. Let-7a might be a new target for nonoperative treatment of cataract.

[Key words] microRNA； let-7a； Caspase family； Cataract

線粒體通路是最主要的凋亡通路，而晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是除先天性白內(nèi)障外其他類型白內(nèi)障形成的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，因而線粒體通路在白內(nèi)障的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。線粒體通路包括發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用的蛋白和發(fā)揮凋亡執(zhí)行作用的蛋白，前者主要是B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2（Bcl-2）家族成員，后者主要是天冬氨酸特異性的半胱氨酸酶（Caspase）家族成員。Caspase家族包括凋亡啟動(dòng)蛋白酶如Caspase-8、Caspase-9等，和凋亡效應(yīng)蛋白酶如Caspase-3等，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[1]。Caspase是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心[2]。

微小RNA（microRNA）是一組全長21～25個(gè)核苷酸、內(nèi)源表達(dá)、單鏈小分子非編碼RNA，通過與靶基因的3非翻譯區(qū)（3UTR）完全或不完全互補(bǔ)配對，抑制靶基因翻譯或介導(dǎo)靶基因降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3-4]。迄今發(fā)現(xiàn)的成熟microRNA有一千多種[5]，動(dòng)物體內(nèi)至少30%的基因表達(dá)受其調(diào)控。microRNA在疾病治療中發(fā)揮著重要作用，特別是在慢性丙型肝炎、肝癌、血脂異常等疾病中的研究已取得突破性進(jìn)展[6-8]。let-7a是最先被鑒定的microRNA之一let-7家族的一員[9]。let-7a在細(xì)胞增殖、凋亡、生長和轉(zhuǎn)移等許多細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的作用[10-12]。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測let-7a可能與Caspase家族中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因存在潛在結(jié)合的位點(diǎn)。因此，本研究以let-7a和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9為研究對象，利用人晶狀體上皮細(xì)胞系及細(xì)胞轉(zhuǎn)染、熒光定量PCR（Real time q-PCR）等方法，探討let-7a是否通過靶向調(diào)控其預(yù)測靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而在白內(nèi)障發(fā)病過程發(fā)揮重要作用，探討let-7a能否成為白內(nèi)障非手術(shù)治療的新靶點(diǎn)。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2014年7～9月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院（以下簡稱“我院”）眼科診斷為年齡相關(guān)性白內(nèi)障（排除其他眼部疾病）的患者行超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)時(shí)撕囊的晶狀體前囊膜標(biāo)本30例，作為實(shí)驗(yàn)組。其中男17例，女13例，年齡50～70歲，平均（56.39±5.13）歲。同時(shí)收集我院眼科眼庫提供的新鮮人眼透明晶狀體前囊膜標(biāo)本15例，作為對照組。其中男9例，女6例，年齡50～70歲，平均（57.37±5.18）歲。組織標(biāo)本收集經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04）由美國Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠贈。SRA01/04細(xì)胞利用DMEM培養(yǎng)基（含10%新生牛血清，100 μg/mL的青霉素，100 μg/mL的鏈霉素），置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。let-7a mimic、inhibitor及其陰性對照由Ribobio公司（中國）合成。將SRA01/04細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）將50 nM let-7a mimic與let-7a mimic control、100 nM let-7a inhibitor與let-7a inhibitor control分別轉(zhuǎn)染至SRA01/04細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 Real time q-PCR檢測let-7a及其預(yù)測靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)

利用Trizol？誖Reagent（Invitrogen，NY，USA）提取總RNA，PrimerScriptTM RT Enzyme Mix（Takara，日本）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqⅡ（Takara，日本）檢測let-7a的表達(dá)量，RNU6B為內(nèi)參對照，檢測Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參對照。let-7a、RNU6B的RT引物、特異性上游引物和通用下游引物由Ribobio公司（中國）合成。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、β-actin引物由生工公司（中國）合成，見表1。利用ABI 7500（Applied Biosystems，USA），反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。經(jīng)過3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，利用公式RQ=2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 let-7a靶基因的預(yù)測

為探討let-7a與Caspase家族成員間的潛在靶向關(guān)系，利用3種引用次數(shù)多、影響因子高、預(yù)測準(zhǔn)確率高的生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan 5.2，Diana-micro T和miRanda的交叉得分，預(yù)測出let-7a與Caspase家族中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9存在潛在結(jié)合位點(diǎn)（見圖1～3），因此推測let-7a可能與Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9可能存在靶向關(guān)系。

圖1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測的let-7a與Caspase-3的結(jié)合位點(diǎn)

圖2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測的let-7a與Caspase-8的結(jié)合位點(diǎn)

圖3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測的let-7a與Caspase-9的結(jié)合位點(diǎn)

2.2 let-7a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中的表達(dá)

采用Real time q-PCR法，檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組眼晶狀體前囊膜中l(wèi)et-7a的表達(dá)情況，以RNU6B作為內(nèi)參對照。結(jié)果顯示，與對照組（1.000±0.002）比較，實(shí)驗(yàn)組let-7a的表達(dá)（0.620±0.019）顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 8.227，P = 0.001）。見圖4。

與對照組比較，**P < 0.01

圖4 let-7a在兩組眼晶狀體組織中的表達(dá)

2.3 預(yù)測靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中的表達(dá)

采用Real time q-PCR法，檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組眼晶狀體前囊膜中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)情況，β-actin作為內(nèi)參對照。結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3的表達(dá)顯著升高[（1.00±0.02）比（2.83±0.06），t = 31.523，P = 0.000]、Caspase-8的表達(dá)顯著升高[（1.00±0.04）比（3.29±0.08），t = 19.919，P = 0.000]、Caspase-9的表達(dá)顯著升高[（1.00±0.03）比（3.22±0.07），t = 12.702，P = 0.000]，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

與對照組比較，**P < 0.01

圖5 預(yù)測靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9

在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中的表達(dá)

2.4 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率

向人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04）中轉(zhuǎn)染let-7a mimic、mimic control、inhibitor、inhibitor control，為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，利用Real time q-PCR法，檢測各組let-7a的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組（1.00±0.03）比較，let-7a mimic轉(zhuǎn)染組（1530.00±246.70）let-7a的表達(dá)顯著升高（t = 37.833，P = 0.000），見圖6A；let-7a inhibitor轉(zhuǎn)染組（0.36±0.02）let-7a的表達(dá)較對照組（1.00±0.01）顯著降低（t = 11.085，P = 0.000），見圖6B；差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明轉(zhuǎn)染有效可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與對照組比較，**P < 0.01；A：轉(zhuǎn)染let-7a mimic；B：轉(zhuǎn)染let-7a inhibitor

圖6 let-7a mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

2.5 let-7a對預(yù)測靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的調(diào)控

向人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04）中分別轉(zhuǎn)染let-7a mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control，轉(zhuǎn)染后48 h，利用Real time q-PCR方法，檢測各組預(yù)測靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染let-7a mimic組，Caspase-3的表達(dá)顯著降低[實(shí)驗(yàn)組：（0.326±0.019），對照組：（1.000±0.003），t = 11.674，P = 0.000，圖7A]，Caspase-8的表達(dá)顯著降低[實(shí)驗(yàn)組：（0.426±0.018），對照組：（1.000±0.005），t = 5.125，P = 0.007，圖7A]，Caspase-9的表達(dá)顯著降低[實(shí)驗(yàn)組：（0.389±0.016），對照組：（1.000±0.004），t = 9.534，P = 0.001，圖7A]；而轉(zhuǎn)染let-7a inhibitor組，Caspase-3的表達(dá)顯著升高[實(shí)驗(yàn)組：（2.326±0.068），對照組：（1.000±0.005），t = 13.199，P = 0.000，圖7B]，Caspase-8的表達(dá)顯著升高[實(shí)驗(yàn)組：（3.147±0.078），對照組：（1.000±0.007），t = 97.861，P = 0.000，圖7B]，Caspase-9的表達(dá)顯著升高[實(shí)驗(yàn)組：（2.889±0.069），對照組：（1.000±0.006），t = 13.805，P = 0.000，圖7B]。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與對照組比較，**P < 0.01；A：轉(zhuǎn)染let-7a mimic；B：轉(zhuǎn)染let-7a inhibitor

圖7 let-7a對預(yù)測靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的調(diào)控

3討論

Caspase家族是線粒體通路中發(fā)揮凋亡執(zhí)行作用的蛋白，屬于天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶[2]，位于胞質(zhì)中，發(fā)揮降解蛋白的作用，它有14個(gè)成員，分為兩大類：一類是凋亡啟動(dòng)蛋白酶，如Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10，另一類是凋亡效應(yīng)蛋白酶，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7；Caspase家族成員能被凋亡抑制蛋白家族（IAP）抑制，失去凋亡執(zhí)行功能。換言之，IAP成員，如XIAP、c-IAPl等，可通過桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)域（BIR）與Caspase成員結(jié)合，抑制Caspase的活性，發(fā)揮抗凋亡作用[13]。Caspase家族引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)[14]，其激活主要包括線粒體依賴途徑和死亡受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活后的下游Caspase，通過切割特異性底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，Caspase-3的激活需要上游的Caspase-8或Caspase-9的活化，后者分別通過死亡受體途徑和Cyt-C介導(dǎo)的線粒體途徑來激活Caspase-3[2]。Caspase家族在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)，是執(zhí)行凋亡的最終途徑。晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是除先天性白內(nèi)障外其他類型白內(nèi)障形成的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。因而Caspase家族，特別是Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等在白內(nèi)障的發(fā)病過程中扮演關(guān)鍵角色。

近年來microRNA的出現(xiàn)，為處于瓶頸期的白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制與非手術(shù)防治研究帶來了新的啟示。國內(nèi)外研究已證實(shí)，microRNA在疾病治療中發(fā)揮著重要作用。microRNA-122、microRNA-26a、microRNA-33a和microRNA-33b分別在慢性丙型肝炎、肝癌、血脂異常的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-8]。雖然目前大部分microRNA的功能及作用機(jī)制尚不清楚，但microRNA在未來人類疾病治療領(lǐng)域，將發(fā)揮超乎想象的重要作用。近年來相繼有microRNA在眼科領(lǐng)域的研究報(bào)道，但多限于microRNA表達(dá)檢測，對其靶基因的預(yù)測及功能驗(yàn)證研究較少。Karali等[15]利用RNA原位雜交技術(shù)，檢測不同發(fā)育階段小鼠眼部組織中microRNA的表達(dá)情況。另有報(bào)道綜合使用基因芯片和RNA原位雜交技術(shù)對角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜和色素上皮細(xì)胞中表達(dá)的microRNA進(jìn)行了全面的檢測，同時(shí)對從胚胎到出生后不同階段鼠的眼部microRNA表達(dá)進(jìn)行了報(bào)道[16]。

let-7a是最先被鑒定的microRNA之一let-7家族的一員[9]。let-7a能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、生長和轉(zhuǎn)移[10]，可能通過抑制c-myc基因的表達(dá)抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖[11]，可促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)下調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)[12]。同時(shí)，let-7家族被證實(shí)與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡顯著相關(guān)[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道，let-7a等通過靶向作用于線粒體通路基因，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。但是，let-7a調(diào)控線粒體通路基因，特別是Caspase家族成員，在晶狀體疾病中的研究尚未見明確報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常人眼晶狀體組織比較，年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中，let-7a的表達(dá)顯著降低，而通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測的其靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)均顯著升高，符合microRNA通過與靶基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合從而抑制靶基因表達(dá)的作用方式，因而推測let-7a與Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9之間可能存在靶向關(guān)系。為進(jìn)一步證實(shí)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9是否為let-7a的靶基因，本研究在人晶狀體上皮細(xì)胞系調(diào)節(jié)let-7a的表達(dá)，觀察Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)變化。本研究發(fā)現(xiàn)，let-7a表達(dá)升高時(shí)，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)均顯著降低，而let-7a表達(dá)降低時(shí)，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)均顯著升高。這一結(jié)果進(jìn)一步表明let-7a與Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)符合microRNA抑制靶基因表達(dá)的作用方式。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，let-7a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中呈低表達(dá)，let-7a可能通過靶向調(diào)控Caspase家族成員Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)，參與白內(nèi)障的發(fā)病過程。let-7a作為白內(nèi)障發(fā)病過程中的重要調(diào)控因子，可能成為白內(nèi)障非手術(shù)治療的新靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究microRNA在白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2015-03-10 本文編輯：任 念）