屈海燕 喬文

[摘要] 目的 探討環(huán)氧合酶-2（COX-2）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子C（VEGF-C）蛋白在胃癌組織中的表達及意義。 方法 采用免疫組化SP法檢測COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在70例胃癌標本和30例正常胃黏膜中的表達情況。 結果COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌細胞胞質中呈棕黃色表達，表達率分別為71.4%、62.9%、55.7%，在正常胃黏膜中的表達率為13.3%、6.7%、16.7%。不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小的COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；不同腫瘤TNM分期、淋巴轉移的COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；不同病理分級的COX-2蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），而VEGF與VEGF-C蛋白的陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。COX-2與VEGF、VEGF-C蛋白，VEGF與VEGF-C蛋白在胃癌組織中的表達呈正相關（P < 0.05）。 結論 COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌組織中高表達，COX-2的表達與VEGF、VEGF-C的表達相關，COX-2可能通過調節(jié)VEGF、VEGF-C蛋白的表達從而調節(jié)胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

[關鍵詞] 胃癌；環(huán)氧合酶-2；血管內皮細胞生長因子；血管內皮生長因子C；免疫組織化學

[中圖分類號] R734 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（b）-0016-04

Expression and significance of COX-2， VEGF and VEGF-C in gastric cancer

QU Haiyan1，2 QIAO Wen1

1.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Medical College of Xi'an Jiaotong University， Shaanxi Province， Xi'an 710061， China； 2.Department of Gastroenterology， Hospital of Traditional Chinese Medicine in Yulin City， Shaanxi Province， Yulin 719000， China

[Abstract] Objective To study the protein expression and significance of cyclooxygenase-2 （COX-2）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and vascular endothelial growth factor C （VEGF-C） in gastric cancer. Methods The expression levels of COX-2， VEGF and VEGF-C were detected by using immunohistochemical SP method in 70 cases of gastric cancer and 30 cases of normal gastric mucosa. Results The positive expression rates of COX-2， VEGF and VEGF-C in gastric cancer were 71.4%， 62.9% and 55.7%； and were 13.3%， 6.7% and 16.7% in normal gastric mucosa. There were no statistical significant differences in positive expression rates of COX-2， VEGF and VEGF-C among patients with different age， sex， tumor site and size （P > 0.05）. There were statistical significant differences among patients with different TNM stages and lymph nodes （P < 0.05）. There were no statistical significant difference in positive expression rate of COX-2 among patients with different pathological grading （P > 0.05）； while there were statistical significant differences in VEGF and VEGF-C （P < 0.05）. There were positive correlation between the expression of COX-2 and VEGF， VEGF-C； VEGF and VEGF-C in gastric cancer （P < 0.05）. Conclusion There are over-expressions of COX-2， VEGF and VEGF-C in gastric cancer tissues. The expression of COX-2 and VEGF， VEGF-C is correlated. COX-2 may regulate the gastric cancer occurrence and progress through regulating the protein expression of VEGF and VEGF-C.

[Key words] Gastric cancer； COX-2； VEGF； VEGF-C； Immunohistochemistry

胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤。國際流行病學資料顯示[1]，20世紀50～90年代，全球胃癌的發(fā)生率及死亡率呈現平穩(wěn)降低的總態(tài)勢，但受人口老齡化、城市化及工業(yè)化等諸多因素影響，世界范圍內每年新病例的絕對數量是增加的。然而近年來，進行我國惡性腫瘤死亡率的國際化比較發(fā)現，我國胃癌世界標化死亡率男性為30.8/10萬，女性為13.8/10萬，均高于世界、發(fā)達及發(fā)展中國家的平均水平，且粗死亡率表現出年齡結構性上升、年齡別死亡率推后等趨勢[2]。本實驗利用免疫組化SP染色法檢測環(huán)氧合酶-2（COX-2）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子C（VEGF-C）蛋白在70例胃癌標本和30例正常胃黏膜中的表達情況，并結合年齡、性別、腫瘤部位、病理分級、臨床分期進一步探討3種蛋白間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集陜西省榆林市中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科2013～2014年的胃鏡活檢及手術胃癌標本70例和30例癌旁正常胃組織。本實驗經醫(yī)院倫理委員會通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。所有標本均經HE染色由我院病理科醫(yī)師診斷。胃癌標本男42例，女28例，按WHO病理分級：高-中分化40例，低分化30例；按UICC標準行TNM標準臨床分期：Ⅰ+Ⅱ級41例，Ⅲ+Ⅳ級29例。

1.2 試劑及檢測方法

濃縮型兔抗人COX-2及VEGF、VEGF-C即用型多克隆抗體和S-P試劑盒均購于北京中杉生物科技有限公司；DAB底物顯色劑購于武漢博士德生物科技有限公司。采用免疫組織化學SP法，染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行。抗原修復采用枸櫞酸鈉緩沖液高壓熱修復。COX-2與VEGF多克隆抗體使用1∶100稀釋，VEGF-C多克隆抗體使用1∶150稀釋。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

COX-2及VEGF、VEGF-C 3種蛋白均以細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達，試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照。免疫組化結果判定如下：陽性細胞占總細胞數0～10%為陰性；>10%～25%為弱陽性；>25%～75%為中等陽性；>75%為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，COX-2及VEGF、VEGF-C在胃癌及正常黏膜中的表達和胃癌臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗；COX-2與VEGF、VEGF-C之間的相關性采用Spearman等級相關分析；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白的表達情況

COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌中陽性表達率為71.4%（50/70）、62.9%（44/70）、55.7%（39/70），而在正常胃黏膜中陽性表達率為13.3%（4/30）、6.7%（2/30）、16.7%（5/30）。經比較，胃癌與正常胃黏膜之間COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達率差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=23.542、26.693、12.995，P < 0.01）。胃癌組織COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白表達在年齡、性別、不同腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小分組上差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），在胃癌淋巴結轉移及臨床分期分組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），在病理分級上COX-2表達差異無統(tǒng)計學意（P > 0.05），VEGF與VEGF-C表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1（封三）、表1。

2.2 胃癌組織中COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白表達間的相關性分析

對70例胃癌組織中COX-2及VEGF、VEGF-C三種蛋白進行Spearman等級相關分析顯示，COX-2與VEGF-C蛋白表達之間存在正相關關系（rs=0.747，P < 0.05）；COX-2與VEGF蛋白表達之間存在正相關關系（rs=0.539，P < 0.05）；VEGF與VEGF-C蛋白表達之間存在正相關關系（rs=0.082，P < 0.05）。

3 討論

胃癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素進行性發(fā)展的過程。生理狀態(tài)下，胃黏膜上皮細胞的增殖和凋亡之間保持著動態(tài)平衡。這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及一些生長因子類物質的共同調控[3]。研究發(fā)現，COX-2是花生四烯酸轉化為前列腺素（PGs）和血栓烷的關鍵酶。COX-2為誘導酶，在大多數的正常細胞中是不存在COX-2的，但在一些腫瘤促進因子、炎癥細胞因子、癌基因和生長因子迅速誘導下形成過量PGs，致使紅腫、發(fā)熱和疼痛等現象的發(fā)生。另有研究報道，COX-2還參與了動脈粥樣硬化、炎癥性腸病和消化性潰瘍的炎性反應。在胃癌漫長的發(fā)生過程中，有效發(fā)病途徑為慢性胃炎-多灶性萎縮-腸上皮化生-不典型增生-浸潤性癌[4]。研究表明，COX-2在結腸癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、鱗狀上皮癌變[8]等多種腫瘤組織中均高表達，其致癌機制有以下幾方面[9]：①通過PGs途徑抑制免疫細胞的活性，減少免疫蛋白的生成，從而抑制抗腫瘤免疫的發(fā)生。②COX-2上調表皮生長因子的表達，誘導腫瘤血管生成，促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。③通過合成花生四烯酸，上調Bcl-2基因表達，抑制腫瘤細胞凋亡。④COX-2自身的過氧化物酶活性作用，與其上調MMP-2、MMP-1蛋白聯(lián)合作用，使腫瘤細胞侵襲力增強。另有研究報道，COX-2還參與了消化性潰瘍、炎癥性腸病[10]和動脈粥樣硬化[11]的炎性反應。在本研究中，胃癌中的COX-2陽性表達率明顯高于正常胃黏膜，并在有無淋巴轉移和臨床分期中表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），表明COX-2與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關，是胃癌轉移的重要機制之一。

胃癌的生長和轉移離不開腫瘤血管的生長，VEGF在結腸癌[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]等多種組織中高表達。研究表明，大多數癌前病變沒有大量新生血管的形成，與腫瘤組織相反，說明癌前病變進展到腫瘤，其大量新生血管形成是腫瘤發(fā)生的關鍵。VEGF是特異性的最強的血管內皮刺激因子，其與血管內皮細胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受體結合后，產生促進血管內皮細胞增殖、遷移的作用，還可以增加血管的通透性，并且在血管通透性方面促進血管內物質滲出到血管外，為促進腫瘤細胞的轉移與浸潤提供了良好的條件[15]。有研究表明，血清中VEGF（S-VEGF）水平在多種癌癥患者體內的水平較正常人高，其在一定程度上可以判斷腫瘤的預后[16]。VEGF-C是VEGF家族成員之一，不僅與只存在淋巴內皮上受體VEGFR-3結合，促進淋巴管生成，還與受體VEGFR-2結合，抑制凋亡并增加血管通透性，并協(xié)同VEGF促進血管的生成[17]。VEGF-C與其受體VEGFR-3結合使VEGFR-3發(fā)生自磷酸化后，誘導淋巴內皮增殖的途徑主要有三方面：①激活MAPK和Akt信號傳導通路，誘導淋巴管內皮細胞增殖，并促進腫瘤細胞轉移[18]；②激活PI3K/Akt信號途徑誘導淋巴管內皮增殖并抑制凋亡[19]；③通過磷酸化Tyrl337位點的Shc和Grb2蛋白，激活PLC-γ/PKC通路促進淋巴管內皮增殖[20]。本研究結果顯示，VEGF與VEGF-C的表達率均高于正常胃黏膜，并都在臨床病理特征中病理分級、淋巴轉移和臨床分期中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。提示VEGF與VEGF-C是胃癌血管、淋巴轉移的重要原因，其水平的檢測對評估腫瘤的侵襲有意義。

COX-2、VEGF共同擁有轉錄啟動子Tcf-4結合位點，可能均受β-catenin蛋白的調控。研究發(fā)現，COX-2生成前列腺素E2（PGE2）致β-catenin蛋白上調，通過激活Wnt/β-catenin通路使VEGF表達升高，并且VEGF可以通過延長COX-2 mRNA的活性時間使COX-2的表達上調[21]。同時，COX-2也是VEGF-C處于轉錄水平的一個重要的上游調控基因[22]。通過COX-2催化產物前列腺素2（PE2）與前列腺素受體EP1結合使HER-2/Neu受體磷酸化，通過MAPK/P38通路激活NF-κB，導致VEGF-C基因蛋白的上調[23]。有學者研究認為，VEGF-C通過與VEGFR-2結合，可以使VEGF表達上調，而Maspin蛋白表達下調可能與VEGF、VEGF-C蛋白的上調有關[24]。本研究結果顯示，COX-2與VEGF、VEGF-C蛋白表達呈正相關，VEGF與VEGF-C蛋白表達之間也存在正相關，提示3種蛋白相互作用，協(xié)同促進胃癌的發(fā)生發(fā)展，同時檢測COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白表達水平，在腫瘤的形成、發(fā)展及早期應用基因靶向治療方面具有積極意義。

綜上所述，COX-2、VEGF、VEGF-C都具有促進胃癌的發(fā)生發(fā)展的作用，COX-2、VEGF、VEGF-C的復雜交互作用在惡性轉化過程中發(fā)揮了重要的作用。胃癌組織中COX-2的表達水平上調，影響VEGF、VEGF-C的表達，并協(xié)同胃癌發(fā)展。3個因子共同檢測可作為臨床判斷腫瘤的侵襲性及轉移潛能的參考指標。

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（收稿日期：2015-01-30 本文編輯：程 銘）