杜江，辛玲，郭穎，周芳＊，于和鳴＊

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，21世紀(jì)男性不育將會是危害人類健康的最嚴(yán)重疾病之一，男性不育因素占不孕不育的40%，且影響男性生育力的危險(xiǎn)因素仍在增加［1］。抑制素B（INH-B）的檢測在男性不育癥的診治中已逐漸得到廣泛的應(yīng)用［2］。研究表明，INH-B是一類糖蛋白激素，因可抑制卵泡刺激素（FSH）分泌而得名。男性體內(nèi)INH 的重要生理活性形式為INH-B，其組裝過程大部分在生精細(xì)胞內(nèi)完成，然后釋放到循環(huán)系統(tǒng)和精液中［3-4］。女性卵泡液中INH-B的含量為幾十ng／ml至幾百ng／ml，比血液及精液中的含量高約103倍［5-6］。而對于人卵泡液及精液中INH-B的相關(guān)研究屈指可數(shù)［7］，并且對于其存在形式和理化性質(zhì)并沒有確切的研究結(jié)果。究其原因主要是由于卵泡液及精液中蛋白種類繁多，不容易從中純化出INH-B，并且收集大量樣品有一定的困難。本實(shí)驗(yàn)擬通過對女性卵泡液中INH-B的分離純化方法及其在卵泡液中分子存在形式的研究，為進(jìn)一步研究INH-B在臨床診斷中的作用打下一定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、研究對象

1.卵泡液樣本：取自北京市家圓醫(yī)院正常女性卵泡液，共25例，均為育齡期女性成熟卵泡。所有樣本均經(jīng)家圓醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，征得志愿者和患者知情同意。

2.主要試劑：兩性電解質(zhì)（Sigma，美國），考馬斯亮藍(lán)R-250（Sigma，美國），牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，美國），Inhibin B Gen II ELISA kit（Beckman，美國），聚乙二醇-20 000（PEG-20 000）（西朧化工），乙腈、丙酮、乙醇（北京試劑廠）。

3.主要儀器：聚丙酰胺凝膠電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、Rotofor System（BIO-RAD，美國），凝膠成像掃描分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備），二乙基氨乙基（DEAE）陰離子交換柱（Pharmacia，美國），紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher，美國）。

二、研究方法

1.Bradford法測總蛋白質(zhì)濃度：將標(biāo)準(zhǔn)BSA 配制成1mg／ml，分別取0、2、4、6、8、10、12、14 和16 μl加入到96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)濃度重復(fù)2次，并以去離子水補(bǔ)至終體積20μl，再加入280μl Bradford工作液，充分混勻，在570nm 紫外波長處測定OD值，利用Excel軟件計(jì)算OD 平均值并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)相關(guān)系數(shù)R2≥0.98時(shí)認(rèn)為兩者間存在線性關(guān)系。將待測樣品1μl加入酶標(biāo)板中，去離子水補(bǔ)至終體積20μl，加入280μl Bradford工作液，同一樣品重復(fù)3次。測OD570nm 值，取3次平均值后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。

2.去除卵泡液中的高豐度蛋白［8］：解凍-20℃保存的卵泡液，4℃12 000r／min 離心15min，分別取上清10 ml，分別與1.2 倍體積的乙腈、丙酮、乙醇混合，立即震蕩混勻5 min，然后3 000r／min 離心15min，取上清，棄沉淀。將上清置于風(fēng)扇下，揮發(fā)至體積10ml。再向各管中加入4倍體積的冷丙酮，-20℃靜置1h，至蛋白沉淀完全，3 000r／min離心15 min，棄上清，留沉淀。室溫放置至丙酮完全揮發(fā)，用2ml雙蒸水（ddH2O）溶解沉淀。

3.聚丙烯酰胺凝膠電泳：取樣品20μl，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min 使蛋白變性。電泳條件：60V恒壓，樣品至濃縮膠與分離膠界限，約30min，150V 恒壓至溴芬蘭到達(dá)凝膠底部，約1h。

4.凝膠染色和脫色：使用新配制的考馬斯亮藍(lán)R-250染色，室溫1h。再用新配的脫色液脫色完全，用ddH2O 漂洗，并用ddH2O 浸泡保存。

5.DEAE-Sephadex A-50 柱 層 析 純 化 方 法［9］：DEAE-Sephadex A-50經(jīng)預(yù)處理、裝柱、平衡、上樣、洗脫后收集樣品，再用紫外分光光度計(jì)分別測定每管OD280nm 值，并以O(shè)D280nm 為縱座標(biāo)，以試管編號為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以PEG-20000洗縮至適當(dāng)體積，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離法（Rotofor System）：取上述純化的樣品20ml，加入2ml兩性電解質(zhì)混勻，再補(bǔ)水稀釋至50 ml，并全部注入Rotofor System樣品槽中，加水補(bǔ)齊至樣品槽中無氣泡。恒功率12 W（電壓為400～500V，電流20～30mA），啟動后4.5h共收集20樣品。

用pH 計(jì)分別測上述收集的20 管樣品的pH值，酸性樣品用0.1 mol／L pH 9.5的Tris-HCl調(diào)pH 至中性；堿性樣品用稀釋10倍的HCl調(diào)pH 至中性。

7.INH-B蛋白含量測定：按照Inhibin B Gen II ELISA kit的操作說明，完成測定。將待測樣品與酶標(biāo)孔表面的抗體起反應(yīng)，用洗滌的方法使酶標(biāo)孔上形成抗原抗體復(fù)合物并與樣品中其他物質(zhì)分開。再分別加入一抗和酶標(biāo)記的二抗，通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合在酶標(biāo)孔上。加入酶反應(yīng)底物后，生成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)儀測450nm 吸光值。

8.蛋白樣品的透析：將需要透析的樣品裝入截流分子量為14 000的透析袋中，袋兩端用封口夾封閉后浸沒于透析液（ddH2O 或上樣緩沖液）中，磁力攪拌，每0.5h更換1次透析液，重復(fù)3次。

9.蛋白樣品的濃縮：將透析處理后的樣品連同透析袋包埋于PEG-20000中，濃縮樣品至所需體積后回收樣品。

結(jié) 果

一、Bradford法繪制BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的OD570值繪制出BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得R2＝0.985，公式為y＝0.0772x＋0.8493。BSA標(biāo) 準(zhǔn) 品 的OD570值 分 別 為：0.849、1.103、1.158、1.313、1.497、1.621、1.776、1.830μg／μl。

圖1 Bradford法繪制BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

二、3 種去除卵泡液中的高豐度蛋白方法的比較

按標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線回歸方程計(jì)算出原樣品的蛋白總量為37mg，經(jīng)3種方法處理后樣品的蛋白總量分別為22.5mg、17.1mg、32.8mg。結(jié)果表明，樣品經(jīng)丙酮、乙醇、乙腈處理后分別可清除60.9%、46.3%、88.7%的高豐度蛋白，即乙腈法處理卵泡原液去除高豐度蛋白是最優(yōu)的方法。（圖2）。

三、DEAE-Sephadex A-50柱層析純化蛋白結(jié)果

DEAE-Sephadex A-50柱層析純化蛋白共收集39管蛋白，從洗脫曲線可看出，洗脫峰出現(xiàn)在第14管和第15管（圖3）。

圖3 DEAE-Sephadex A-50柱層析純化蛋白洗脫曲線

四、Rotofor System 蛋 白 分 離 及 等 電 點(diǎn) 鑒 定結(jié)果

對Rotofor System 所收集的20管樣品處理后用Inhibin B Gen II ELISA kit檢測每管中INH-B的濃度，其中第3 和第4 管INH-B 的濃度分別為590pg／ml和750pg／ml，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）分離法測得第3和第4管pI值分別為4.5和4.6。由此可推斷出卵泡液中INH-B 的pI在4.55左右（表1）。

五、目的蛋白INH-B的回收率

采用Inhibn B Gen II ELISA kit試劑盒繪制INH-B濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，INH-B標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為0、10、30、100、250、500、1 000pg／ml，其對應(yīng)OD450值 依 次 為0、0.051、0.142、0.503、1.192、2.085、3.179。其 中R2＝0.9718，公 式 為y＝298.95x-35.445（圖4）。

以100 ml原始卵泡液為初始樣品，樣品中總INH-B的含量為17.3μg。經(jīng)乙腈、DEAE-Sephadex A-50柱層析、Rotofor System 蛋白分離3次處理，依次編號為1、2、3，各步樣品中INH-B 的含量分別為10.7、8.9、6.7μg，經(jīng)過3次純化后回收率為38.70%（表2）。

表1 測量20管樣品INH-B的濃度和pI值

圖4 INH-B濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 目的蛋白INH-B的回收率

討 論

女性體內(nèi)INH-B由卵巢中、小竇卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，具有反饋性抑制垂體FSH 分泌和調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞發(fā)育的重要功能，可直接反映卵巢儲備功能。INH-B的監(jiān)測在女性生殖及輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用有重要意義［10］。

男性體內(nèi)INH-B 是直接由睪丸分泌的二聚體糖蛋白激素，對多種外源性激素起反應(yīng)。血清INH-B水平受年齡、睪丸體積、青春期發(fā)生時(shí)間、標(biāo)本采集時(shí)間、不同人群等多種因素影響。INH-B 能直接反映睪丸的精子發(fā)生，可作為臨床評價(jià)男性生育力的重要指標(biāo)［11-12］。睪丸穿刺活檢是診斷無精子癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但血液中INH-B水平檢測作為部分替代和補(bǔ)充，可作為睪丸生精障礙的間接診斷依據(jù)，但這一依據(jù)的準(zhǔn)確性依然存在爭議［13-14］。因此，隨著生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展，直接以精液為研究、檢測材料的方法引起人們的興趣。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，最新的對于血液中INH-B 存在形式的研究已經(jīng)很完整［15］，而對于男性精液和女性卵泡液中INH-B的存在形式及其理化特性的相關(guān)研究基本上是空白。由于受到材料的限制，以往對于INH-B純化方法的研究，多取材于動物，如豬卵泡液［9］等。本實(shí)驗(yàn)則使用人卵泡液為實(shí)驗(yàn)材料，利用INH-B 本身的生化性質(zhì)，通過乙腈富集、陰離子交換柱分離、等電點(diǎn)分離的“三步分離法”，初步純化獲得人體卵泡液中天然INH-B蛋白分子粗制品，純化回收率達(dá)38.70%，并準(zhǔn)確鑒定出其在人體中的等電點(diǎn)為4.55左右，為近一步研究人體INH-B的功能和結(jié)構(gòu)特征打下基礎(chǔ)，可能為臨床診斷產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的思路和理論依據(jù)。

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