葛寶坤，陳旭艷，李淑靜

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

我國(guó)主產(chǎn)區(qū)18種鮮橙中糖的HPLC測(cè)定研究

葛寶坤，陳旭艷，李淑靜*

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

采用30%的乙腈水（體積比）為稀釋液，建立了樣品直接稀釋、高效液相色譜（HPLC）分離、示差折光檢測(cè)器檢測(cè)（RID）快速測(cè)定鮮橙中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的可靠方法。該方法以保留時(shí)間（Rt）定性，外標(biāo)法定量；在0.05 mg/mL～5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 5；樣品在5.0、10.0、25.0 g/kg 3個(gè)加標(biāo)水平內(nèi)的回收率范圍為95%～101%（n=10），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%；方法的定性檢出限（LOD）為0.05 g/kg、定量檢出限（LOQ）為0.15 g/kg，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏的特點(diǎn)。應(yīng)用本方法對(duì)產(chǎn)自四川、云南、湖北、重慶等7個(gè)產(chǎn)地的18個(gè)不同品種的鮮橙進(jìn)行了4種糖含量的檢測(cè)，結(jié)果表明4種還原糖含量因品種、產(chǎn)地不同而有差異。

HPLC；RID；鮮橙；糖含量

鮮橙營(yíng)養(yǎng)豐富，富含各種糖、VC、有機(jī)酸等，VC是人體是必須的維生素之一，它有利于提高人體免疫力[1]，防止人體衰老，降低膽固醇等作用[2]；橙汁的品質(zhì)不僅取決于鮮橙的出汁率、固形物、含糖量等因素，還取決于鮮橙的口感及風(fēng)味，由于鮮橙中含糖的種類(lèi)及含量是決定鮮橙風(fēng)味、甜度、口感和品質(zhì)的重要因素之一；也為人們更好地選擇優(yōu)質(zhì)的鮮橙提供依據(jù)。因此分析鮮橙中的糖類(lèi)及含量，建立鮮橙中各種糖類(lèi)及含量的指紋圖譜，對(duì)鮮橙的品種、產(chǎn)地尤為重要。液相色譜法同時(shí)測(cè)定鮮橙中糖含量的方法未見(jiàn)報(bào)道，盡管有測(cè)定糖的國(guó)標(biāo)方法[3-5]，但該方法均不適用鮮橙樣品。目前，測(cè)定糖的方法主要有滴定法[6]、液相色譜法[7-11]。本文研究并建立了采用樣品直接稀釋前處理、HPLC分離、RID檢測(cè)器檢測(cè)、一次進(jìn)樣可同時(shí)檢測(cè)鮮橙中的4種糖的方法，獲得了滿意的結(jié)果，也填補(bǔ)了我國(guó)鮮橙中4種糖含量測(cè)定方法的空白。利用本文研究方法，基本建立起了我國(guó)主產(chǎn)區(qū)鮮橙中的糖類(lèi)含量分布信息庫(kù)，對(duì)鮮橙的原產(chǎn)地保護(hù)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters公司e2695高效液相色譜儀，配2414視差折光檢測(cè)器；MILLIPORE公司MILLI-Q純水儀；HITACHI CR22G III型高速離心機(jī)。

1.2 試劑

乙腈：色譜純。

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，含量≥99%。

糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)品，用30%的乙腈水溶解、混勻、定容，即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，標(biāo)準(zhǔn)使用液是將儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋至所需要的濃度。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備

鮮橙去皮，采用積壓方式取出橙汁，混勻，取橙汁1.0 g（精確至0.01 g）于15 mL離心管中，用30%的乙腈水直接稀釋定容至10 mL，混勻，4℃、10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜進(jìn)液相色譜儀分析測(cè)定。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：WATERS，ENERGY ANALYSIS NH2，300 mm×3.9 mm，10 μm，或相當(dāng)者；流動(dòng)相：乙腈+水= 75%+25%；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)池溫度：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3 分析測(cè)定

根據(jù)樣液中被測(cè)水溶性糖的含量情況，選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)樣液中水溶性糖的響值均應(yīng)在工作曲性范圍內(nèi)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)樣液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。在1.3.2的色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品、鮮橙樣品的色譜圖和保留時(shí)間見(jiàn)圖1。

圖1色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（a）、鮮橙樣品色譜圖（b）Fig.1LC chromatograms of standard solution

1.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)來(lái)自四川、云南、湖北、重慶、江西、廣西、福建7個(gè)產(chǎn)地的冰糖橙、錦橙、血橙、椏橙、伏令夏橙、早金甜橙、倫晚臍橙、耐濕臍橙等18個(gè)品種的鮮橙進(jìn)行了四種糖含量的檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 稀釋液配比的優(yōu)化

研究了水、甲醇水、乙腈水直接稀釋法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，研究表明：甲醇水因含有醇羥基對(duì)視差折光檢測(cè)器有較大的吸收而影響測(cè)試結(jié)果；直接用水稀釋不僅會(huì)形成較大的水峰，而且水峰還不能與甘油峰完全分開(kāi)，造成測(cè)試結(jié)果的偏離；另對(duì)乙腈水的配比研究還發(fā)現(xiàn)：采用30%的乙腈水直接稀釋樣品可使水峰較小、4種待測(cè)成分分離較高、基線噪音低，因此，本研究?jī)?yōu)選30%的乙腈水（體積比）為樣品直接稀釋液。

2.2 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

取一定濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用30%的乙腈水分別稀釋成濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.0、5.0 mg/mL，按照本方法色譜條件分析測(cè)定，繪制工作曲線，4種成分別在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 方法的回收率與精密度

取鮮橙樣品1.0 g（精確至0.01 g），按照5.0、10.0、25.0 g/kg 3個(gè)加標(biāo)水平，按本方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，并做6個(gè)平行樣，結(jié)果為果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的平均回收率均在95%～101%，精密度均小于5.0%，本方法的穩(wěn)定性良好，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 方法的測(cè)定限

取系列鮮橙樣品1.0 g，由高到低依次加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法色譜條件測(cè)定樣品加標(biāo)結(jié)果，根據(jù)信噪比S/N=10為本方法的定量限（LOQ）、S/N=3為本方法的定性限（LOD）計(jì)算出方法的最低檢測(cè)限，四種糖的定性檢出限（LOD）為0.05 g/kg、定量檢出限（LOQ）為0.15 g/kg。

2.5 方法的抗干擾試驗(yàn)

為了確定方法的抗干擾能力及適用性，分別選取鮮橙及橙汁中常見(jiàn)的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、檸檬黃、日落黃、檸檬酸、VC等干擾物，按照本方法條件進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示4種待測(cè)組分的色譜峰分離度和重現(xiàn)性均較好，上述干擾成分均不干擾結(jié)果測(cè)定。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)試

來(lái)自不同產(chǎn)地的18種鮮橙中4種可溶性糖的含量分別為：果糖含量為1.5%～8.8%、葡萄糖含量為1.4%～8.3%、蔗糖含量為1.1%～9.1%、麥芽糖含量為0.1%～0.6%，見(jiàn)表2。

表1 方法的靈敏度、線性關(guān)系及回收率（n=6）Table 1Sensitivities，linearships and recoveries of the method（n=6）

表2 18種鮮橙中可溶性糖含量Table 2Content of glycerol in 18 fresh orange

檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，不同產(chǎn)地的鮮橙中4種糖的總含量差異在2.5倍以上，直接反應(yīng)鮮橙甜度指標(biāo)的果糖含量高低差別近6倍，因此鮮橙中的糖含量測(cè)定及其建立可靠的測(cè)試方法，對(duì)確保鮮橙的原產(chǎn)地保護(hù)、產(chǎn)品質(zhì)量、真?zhèn)舞b別，并建立起我國(guó)主產(chǎn)區(qū)鮮橙指紋譜圖信息庫(kù)具有重要的意義。

3 結(jié)論

本文研究的檢測(cè)方法4種糖組分在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 5；樣品在5.0、10.0、25.0 g/kg 3個(gè)加標(biāo)水平內(nèi)的回收率范圍為95%～101%，6次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%；方法的定性檢出限（LOD）為0.05 g/L、定量檢出限（LOQ）為0.15 g/L，符合色譜分析的方法要求。對(duì)實(shí)際樣品測(cè)試的結(jié)果表明，該方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、不需要SPE凈化柱、試劑消耗少、對(duì)環(huán)境污染小等特點(diǎn)，便于推廣與應(yīng)用。

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Determination of Glycerol in 18 Fresh Orange by High Resolution Liquid Chromatography（HPLC）

GE Bao-kun，CHEN Xu-yan，LI Shu-jing*
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

A method was developed for simultaneous determination of fructose，glucose，sucrose and maltose in fresh orange.The sample was diluted directly by acetonitrile-H2O（30%，v/v），and then analyzed by highperformance liquid chromatography（HPLC）with refractive index detector（RID）.The method for qualitative analysis was based on retention time.And external standard method was used for calculation.Good linear relationship was achieved in the range of 0.05 mg/mL-5 mg/mL for the 4 components with correlation coefficients above 0.999 5.The recoveries of the method ranged from 95%to 101%（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）below 5.0%at 3 spiked levels of 5.0，10.0，25.0 g/kg.The limit of detection（LOD）of this method is 0.05 g/kg，while the limit of quantification（LOQ）was 0.15 g/kg.This is a simple，rapid，sensitive method for detection fructose，glucose，sucrose and maltose.18 kinds of oranges from 7 fields（Si Chuan，Yun Nan，Hu Bei，Chongqing et al）were analyzed by the method and the results showed the content of fructose，glucose，sucrose and maltose depended on the varieties and field of orange.

HPLC；RID；fresh orange；glycerol

2014-09-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.028

國(guó)家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201310146）

葛寶坤（1968—），男（漢），研究員，本科，研究方向：食品中藥物殘留及添加劑檢測(cè)技術(shù)。

*通信作者：李淑靜，高工，博士。