范露，劉茹，熊善柏，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205；3.國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北武漢430070）

魚蛋白肽鈣的分級(jí)及肽與鈣的結(jié)合性能研究

范露1，2，劉茹1，3，熊善柏1，3，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205；3.國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北武漢430070）

以白鰱采肉后的魚骨為原料制備魚蛋白肽鈣，用無(wú)水乙醇分級(jí)分離得到6個(gè)級(jí)分：水不溶性級(jí)分CA、50%、60%、70%、80%、90%乙醇不溶性級(jí)分CB、CC、CD、CE、CF，采用紅外分析法和葡聚糖凝膠色譜法等手段比較了各級(jí)分間的差異。結(jié)果表明：各級(jí)分中均含有一定量的肽和鈣，6個(gè)級(jí)分可以歸為3類：CA得率最高，水溶性最差，鈣通過(guò)化學(xué)鍵與分子量較大的肽結(jié)合；CB、CC相似，得率最低，鈣通過(guò)化學(xué)鍵與小肽或氨基酸結(jié)合；而CD、CE和CF三者相似，水溶性好，鈣呈游離態(tài)，通過(guò)物理吸附作用與魚蛋白肽結(jié)合。

魚蛋白肽鈣；分級(jí)；結(jié)合性能；紅外分析法；葡聚糖凝膠色譜法

鈣是人體中含量最多的礦質(zhì)元素，具有構(gòu)成骨骼和牙齒、維持神經(jīng)肌肉正?；顒?dòng)、參與凝血等多項(xiàng)功能，對(duì)人體非常重要，而我國(guó)膳食結(jié)構(gòu)以素食為主，含鈣少，吸收差，因此補(bǔ)鈣非常必要，通過(guò)改善膳食結(jié)構(gòu)增加乳類攝入可以增加鈣的攝入，但必要時(shí)必須通過(guò)鈣制劑來(lái)補(bǔ)充機(jī)體鈣質(zhì)。

鈣制劑經(jīng)歷了無(wú)機(jī)鈣、有機(jī)酸鈣和螯合鈣3個(gè)階段，氨基酸螯合鈣和蛋白肽螯合鈣以其穩(wěn)定性好、吸收率高等特點(diǎn)備受關(guān)注[1]。氨基酸螯合鈣研究較多，關(guān)于制備、結(jié)構(gòu)鑒定、特性及應(yīng)用等均有不少報(bào)道[2-4]。蛋白肽螯合鈣多是以富含蛋白的原料通過(guò)水解制取多肽，再與鈣鹽反應(yīng)制得螯合鈣。而以蛋白水解產(chǎn)物為原料制備螯合物時(shí)，蛋白水解物本身就是一個(gè)復(fù)雜的體系，因此鈣與肽的結(jié)合可能存在多種方式。楊燊[5]、夏松養(yǎng)[6]等采用酶水解南海低值魚蛋白制備多肽復(fù)合物并制得多肽-鈣螯合物，通過(guò)紅外光譜分析推測(cè)鈣離子與羧基以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，并采用0%、50%和80%的乙醇對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)，結(jié)果表明未經(jīng)乙醇沉淀的級(jí)分抗氧化活性最強(qiáng)；祝德義[7]研究了酶法水解動(dòng)物皮制得的膠原多肽與Ca2+的結(jié)合行為，通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡等手段對(duì)結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行初步表征，表明膠原多肽和Ca2+有一定的結(jié)合能力，且結(jié)合反應(yīng)比較復(fù)雜，既有配位結(jié)合，又有離子鍵結(jié)合，還有吸附作用；Bao等[8]采用透析、凝膠色譜及紅外對(duì)大豆水解液和鈣離子生成的可溶性多肽鈣進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分子量在14.4 KDa和8 KDa～9 KDa的多肽與鈣離子的結(jié)合能力最強(qiáng)，且鈣與多肽的結(jié)合能力與羧基基團(tuán)的含量線性相關(guān)。Jung等[9]在pH2.2醋酸環(huán)境下用胃蛋白酶水解魚骨架，采用超濾和親和色譜法分離出與鈣離子親和力最高的多肽，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜儀分析得到與鈣螯合程度最高的小肽分子序列，其與鈣的結(jié)合能力與酪蛋白磷酸肽相當(dāng)。

魚骨是魚糜制品加工中產(chǎn)生的主要下腳料，就常用的鰱魚而言，在加工過(guò)程中魚骨約占魚體總重的10%，魚頭和魚骨一起達(dá)到了40%[10]，占整個(gè)下腳料的2/3[11]。魚骨中不僅含有大量的鈣磷，還含有豐富的蛋白質(zhì)，將魚骨加工制備魚蛋白肽鈣制劑可大大提高其附加值。本研究通過(guò)對(duì)魚蛋白肽鈣不同級(jí)分之間的比較，探尋各級(jí)分間的差異，為進(jìn)一步研究其性質(zhì)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱購(gòu)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)集貿(mào)市場(chǎng)；復(fù)合蛋白酶（6.49萬(wàn)U/g）：諾維信天津公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DJ550-A型絞肉機(jī)：沈陽(yáng)市廚房設(shè)備廠；Avanti J-26型高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼公司；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)：Unico；NEXUS 470 FTIR型紅外光譜儀：美國(guó)Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 魚蛋白肽鈣的制備及分級(jí)

采用不同濃度乙醇梯度沉淀將反應(yīng)產(chǎn)物分為6個(gè)級(jí)分。反應(yīng)結(jié)束后，于5 000 r/min離心10 min，所得沉淀記為CA，上清液繼續(xù)補(bǔ)充加入無(wú)水乙醇至體系乙醇濃度50%，于5 000 r/min離心10 min，所得沉淀記為CB，依次往前一次離心上清液中加入無(wú)水乙醇，使體系乙醇濃度分別達(dá)到60%、70%、80%、90%，離心所得沉淀依次為CC、CD、CE和CF。CA～CF各級(jí)分質(zhì)量占合成產(chǎn)物總質(zhì)量的比例即為該級(jí)分相對(duì)得率。反應(yīng)前的魚蛋白肽記為C0。

1.3.2 肽含量的測(cè)定

微量凱氏定氮法[12]。

1.3.3 鈣含量的測(cè)定

GB/T－6436-2002 EDTA絡(luò)合滴定法。

1.3.4 溶解率的測(cè)定

參考胡莉莉的方法[13]。

1.3.5 紅外光譜分析

將樣品于105℃烘干后與KBr在遠(yuǎn)紅外快速干燥器下于瑪瑙研缽中研細(xì)混勻，壓片，在NEXUS-470型傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外掃描。掃描范圍4 000cm-1-400cm-1，儀器分辨率4cm-1，掃描次數(shù)32次。

1.3.6 肽鈣分布測(cè)定

將樣品配制成10 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，用Sephadex G-25凝膠過(guò)濾層析，收集洗脫液，檢測(cè)每管樣品在280 nm下的吸光值，同時(shí)用1.3.3法測(cè)定每管中的鈣含量，并以每次洗脫收集到的第1管的鈣含量為基準(zhǔn)，后續(xù)每管中的鈣含量與第1管鈣含量的比值即為鈣相對(duì)含量。層析條件：上樣量3 mL，洗脫液為0.02%迭氮化鈉-0.9%氯化鈉溶液，采用部分收集器收集，4.8 mL/管，6管/h。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SAS和Excel軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)所制備的魚蛋白肽鈣各級(jí)分經(jīng)50℃烘干后均呈淡黃色晶體狀，無(wú)異味，其中級(jí)分CD、CE和CF易吸潮結(jié)塊。

2.1 魚蛋白肽鈣的基本組成

魚蛋白肽鈣分級(jí)后各級(jí)分的相對(duì)得率如表1所示。

表1 魚蛋白肽鈣各級(jí)分肽和鈣含量（n=3，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 1Content of peptide and calcium for every components（n=3，means±SD）

由表1可知，產(chǎn)物中級(jí)分CA所占比例最大，CD、CE和CF次之，級(jí)分CB和CC最少。在魚蛋白肽鈣分級(jí)過(guò)程中，未加乙醇時(shí)水不溶性成分沉淀下來(lái)，得到級(jí)分CA；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度由0%增加到40%時(shí)，所沉淀產(chǎn)物極少，當(dāng)乙醇濃度達(dá)50%時(shí)，部分產(chǎn)物被分離出來(lái)，即級(jí)分CB；乙醇濃度繼續(xù)提高至60%時(shí)，此階段獲得的產(chǎn)物CC很少，所占比例最??；繼續(xù)增大乙醇濃度至70%、80%、90%，醇不溶性成分逐漸被沉淀。

各級(jí)分的肽含量、鈣含量及肽鈣比例亦有差異。級(jí)分CA、CB、CC的肽含量較低，鈣含量較高，肽鈣比例小；級(jí)分CD、CE、CF肽含量較高，鈣含量較低，肽鈣比例較大。

2.2 魚蛋白肽鈣的溶解性

溶解性是鈣制劑的一項(xiàng)重要質(zhì)量指標(biāo)。魚蛋白肽鈣各級(jí)分溶解率結(jié)果如圖1所示。

圖1 魚蛋白肽鈣各級(jí)分溶解率（n=3）Fig.1 Ratio of dissolution for every components（n=3）

由圖1可知，級(jí)分CA溶解性最差，級(jí)分CE和CF溶解性最好，在pH2、pH7和pH10中均幾乎完全溶解。在分級(jí)過(guò)程中，隨著體系乙醇濃度的增大，水溶性差的產(chǎn)物先沉淀，水溶性好的產(chǎn)物后沉淀，因此各級(jí)分溶解率隨沉淀時(shí)所用乙醇濃度的增大而增大。此外，級(jí)分CA和CB的溶解率受pH影響較大。

2.3 魚蛋白肽鈣的紅外光譜分析

圖2是魚蛋白肽和反應(yīng)后魚蛋白肽鈣各級(jí)分紅外光譜圖。

圖2 魚蛋白肽鈣各級(jí)分紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectroscopy spectra of every components

反應(yīng)前的魚蛋白肽（C0）的譜圖中位于3 300 cm-1吸收峰為蛋白質(zhì)的N-H伸縮振動(dòng)引起；位于1 660 cm-1吸收峰是由C=O伸縮振動(dòng)引起，屬于酰胺Ⅰ帶；1590cm-1吸收峰為N-H面內(nèi)彎曲產(chǎn)生，屬于酰胺Ⅱ帶，但部分為酰胺Ⅰ帶所掩蓋；1 410 cm-1伯酰胺C-N伸縮振動(dòng)吸收峰，也稱為酰胺Ⅲ帶[7，14-16]。

與魚蛋白肽C0相比，魚蛋白肽鈣各級(jí)分與之差異大小不一，從CA、CB、CC、CD、CE至CF，各級(jí)分與C0的差異逐漸縮小。加入Ca2+后，3 300 cm-1的N-H伸縮振動(dòng)峰均有所加強(qiáng)；酰胺I帶由1 660 cm-1紅移至1 500 cm-1～1 400 cm-1不等；另外1 100 cm-1左右較弱的鋸齒形吸收峰強(qiáng)度增大，CA最為明顯，變?yōu)橐还饣瑥?qiáng)峰，此峰為-NH2的面內(nèi)搖擺振動(dòng)，同時(shí)900 m-1左右的一個(gè)小吸收峰在CA、CB、CC中較明顯，為N-H的面外彎曲振動(dòng)，證明了CA中Ca2+與魚蛋白肽結(jié)合緊密，其次是CB和CC。級(jí)分CD、CE和CF的紅外圖譜的峰形及峰強(qiáng)度與魚蛋白肽C0較相似，推測(cè)其中鈣與肽的相互作用可能比較微弱。

2.4 魚蛋白肽鈣的肽鈣分布

魚蛋白肽鈣的肽鈣分布結(jié)果見圖3。

由圖3肽鈣分布圖可知，根據(jù)肽與鈣的相對(duì)出峰位置，6個(gè)級(jí)分的肽鈣分布可歸為3類：第一類是級(jí)分CA[圖3（c）]，該級(jí)分中鈣的分布明顯不同于游離鈣[圖3（a）]，峰形尖而窄，出峰時(shí)間稍早于游離鈣，且其尖峰恰好與肽的第一個(gè)峰重合，說(shuō)明該級(jí)分中鈣與大分子量肽段緊密結(jié)合，印證了紅外分析結(jié)果；第二類包括CB[圖3（d）]和CC[圖3（e）]兩個(gè)級(jí)分，該級(jí)分的鈣出峰時(shí)間較晚，鈣的峰值在肽的峰值之后，可能是鈣與小肽或氨基酸結(jié)合在一起，而這些小肽或氨基酸在280 nm處并無(wú)吸收；第三類包括級(jí)分CD[圖3（f）]、CE [圖3（g）]和CF[圖3（h）]，這3個(gè)級(jí)分中雖然鈣峰與肽峰部分重疊，但其中鈣的峰形和出峰時(shí)間與游離鈣[圖3（a）]很相近，推斷其中的鈣與肽或氨基酸未形成化學(xué)鍵，而是以游離態(tài)存在，鈣僅通過(guò)物理吸附作用

圖3 魚蛋白肽鈣各級(jí)分肽鈣分布圖Fig.3 Peptide and calcium distribution of every components

而聚集在肽周圍，結(jié)合力較弱，在凝膠色譜中二者分離開來(lái)，因此高濃度的乙醇沉淀下來(lái)的產(chǎn)物可能是肽和游離鈣的混合物，這恰好解釋了CD、CE和CF 3個(gè)級(jí)分的紅外圖譜與未經(jīng)反應(yīng)的魚蛋白肽相差不大的原因。

3 結(jié)論

采用無(wú)水乙醇對(duì)魚蛋白肽鈣進(jìn)行分級(jí)可獲得CA、CB、CC、CD、CE和CF 6個(gè)級(jí)分，通過(guò)對(duì)各級(jí)分的相對(duì)得率、基本組成、水溶性、紅外光譜分析和肽鈣分布等的比較，發(fā)現(xiàn)各級(jí)分中均含有一定量的肽和鈣，6個(gè)級(jí)分可歸為3類：水不溶性的CA得率最高，水溶性最差，鈣通過(guò)化學(xué)鍵與分子量較大的肽緊密結(jié)合；不溶于50%和60%乙醇的CB、CC相似，得率最低，鈣通過(guò)化學(xué)鍵與小肽或氨基酸緊密結(jié)合；而不溶于70%、80%和90%乙醇的CD、CE和CF三者相似，水溶性好，鈣呈游離態(tài)，通過(guò)物理吸附與魚蛋白肽結(jié)合。本研究可為蛋白肽鈣的分離和純化提供依據(jù)。

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Studies on Classification of Fish Protein Peptides-calcium and Combination between Peptide and Calcium

FAN Lu1，2，LIU Ru1，3，XIONG Shan-bai1，3，*
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China；2.College of Food and Biology Science and Technology，Chutian College，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430205，Hubei，China；3.National R＆D Branch Center For Conventional Freshwater Fish Processing（Wuhan），Wuhan 430070，Hubei，China）

Fish protein peptides-calcium was prepared from silver carp bone.It was divided into six components：deposit after reaction component CA，deposit in 50%，60%，70%，80%and 90%alcohol solution called CB，CC，CD，CE and CF，respectively.Meanwhile，the differences of the components were inspected with the method of IR and Sephadex.Both peptide and calcium existed in every components.And the six components can be cataloged as three kinds.The CA possessed highest yield and the poorest water-soluble capacity.Ca2+was combined with polypeptide by chemical bond in CA.The yield of CB and CC was the lowest. Ca2+was combined with micromolecular peptide or amino acid by chemical bond in CB and CC.The other components（CD，CE and CF）possessed the highest water-soluble capacity.Ca2+existed in free state or was combined with peptide by physical adsorption.

fish protein peptides-calcium；classification；combination；infrared spectroscopy；sephadex chromatography

2013-12-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.002

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-46-23）

范露（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品大分子提取及應(yīng)用。

*通信作者：熊善柏（1963—），男（漢），教授，碩士，研究方向：水產(chǎn)品加工及貯藏工程。