宓捷波，許迪明，李淑靜，林安清，許泓

（1.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461；2.寧波出入境檢驗檢疫局，浙江寧波315000）

奶粉中殘留獸藥的QuEChERS方法應用研究

宓捷波1，許迪明2，李淑靜1，林安清1，許泓1

（1.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461；2.寧波出入境檢驗檢疫局，浙江寧波315000）

通過萃取溶劑和鹽析劑等優(yōu)化，改進了QuEChERS技術。建立了奶粉中22種獸藥殘留檢測的簡捷、快速、特異性的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。該方法通過EDTA和緩沖體系優(yōu)化了磺胺、喹諾酮和四環(huán)素類藥物的萃取檢測過程，使磺胺、喹諾酮和四環(huán)素的檢測低限達到1、5 μg/kg和50 μg/kg，添加回收率為70%～102%，RSD小于15%。

QuEChERS；奶粉；獸藥殘留

自三聚氰胺事件以來，我國對奶粉及相關奶制品的檢測的嚴格程度達到了前所未有的高度，僅牛奶和奶粉相關的國家標準就制定發(fā)布了31項之多，范圍涉及近百種獸藥，為保障奶粉類食品的安全提供了完備的檢測依據。然而，面對近百種的在用獸藥，大量的奶制品需要做獸藥殘留分析，檢驗任務既繁重又時間緊迫。而上述31項關于牛奶和奶粉中殘留檢測的國家標準，基本上都采用了目前較為流行的前處理模式，即溶劑提取+固相萃?。⊿PE）柱凈化，這一模式相對于原先的液液萃取而言，可以避免乳化，較為快速，但在具體操作過程中，由于奶粉含有較多的脂肪和蛋白質，SPE柱的凈化過程通常需要加壓或負壓方式進行，速度受到極大的限制。尤其在樣品量較多的情況下，整個前處理過程就會變得十分冗長。因此加強樣品前處理技術的研究，提高對食品樣品中殘留獸藥的提取效率，在保證檢測精度的基礎上減少前處理的操作步驟，發(fā)展快速、高效、靈敏、簡捷的獸藥殘留檢測方法對于保障國家的食品安全、環(huán)境質量、人體健康具有重大意義。

QuEChERS是基于分散固相萃取建立起來的一種多殘留快速（Quick）、簡單（Easy）、便宜（Cheap）、高效（Effective）、耐用（Rugged）和安全（Safe）的分析方法。自2003年提出以來[1]，QuEChERS方法已在全球獲得了廣泛的應用。尤其在農藥殘留檢測上取得了極大的成功，在蔬果已可以實現近百種的多殘留檢測，如Banerjee K等[2]在葡萄基質中對82種農藥進行了萃??；Cajka T等[3]則在蔬果中對100種農藥實現萃取。近年來經過一些改進，也可用于谷物、堅果、土壤、蜂蜜等樣品[4-8]，但基本局限于農藥的提取，對于食品樣品中殘留的獸藥的QuECHERS萃取研究很少[9-10]，并且在動物源性食品中的應用也很少。本研究以奶粉為研究基質，對現有的QuEChERS方法的提取環(huán)境和萃取劑等進行研究改進，建立適合于奶制品中多類獸藥殘留檢測的快速方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效色譜-質譜/質譜儀Agilent1290-API4000+（Agilent公司/AB SCiex公司，美國），配備RRHD E－clipse Plus C18色譜柱；離心機Avanti J-26 XPI（貝克曼公司，美國），氮吹儀N-EVAP112（Organomation Associates公司，美國）。

1.2 試劑

磺胺惡喹啉、磺胺苯吡唑、磺胺多辛，磺胺二甲異惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、西諾沙星、丹諾沙星、洛美沙星、氟羅沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星標準品以及13C6-磺胺二甲嘧啶、D5-諾氟沙星均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司（德國）。伯仲胺（PSA）、氨基（NH2）和強陰離子交換（SAX）吸附材料均購自安捷倫公司（美國）乙腈、冰乙酸和甲酸均為色譜純（Merck公司，德國），無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、乙酸鈉和乙二胺四乙酸（EDTA）均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.3 方法

1.3.1 QuEChERS萃取

稱取1 g奶粉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL水溶解，混合均勻后加入10 mL 1%乙酸乙腈和10 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，振搖1 min，加入8 g無水硫酸鈉和1 g乙酸鈉，振搖充分，3 500 r/min離心5 min，取上清過無水硫酸鈉層于15 mL離心管中，40℃氮氣吹干，用1 mL0.1%甲酸水/乙腈（9∶1）溶解，過0.22 μm尼龍濾膜，進行液相色譜串聯質譜檢測。

1.3.2 測定

線條表面平滑而呈黑色，這種腹中線沒有腹壁斷裂，只是體質原因導致黑色素沉積而已，并非孕婦特有，未孕育人群也可發(fā)生。

1.3.2.1 超高壓液相色譜條件

Eclipse Plus C18色譜柱（2.1×50 mm；1.8 μm），流速0.5 mL/min，進樣量5 μL，流動相A為0.1%甲酸的水，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序如表1。

表1 液相色譜的梯度洗脫程序Table 1The gradient elution program of LC

1.3.2.2 質譜條件

ESI+模式，碰撞氣流量（CAD）：12L/h，氣簾氣（CUV）：2.06×105Pa；輔助氣1：4.83×105Pa；輔助氣2：4.48× 105Pa；噴霧電壓（IS）：5500V；離子源溫度（TEM）：600℃。采用多反應檢測（MRM，multiple reaction monitoring），每種獸藥選擇兩對離子對進行檢測，其中一對為定量離子，另一對為定性離子，具體如表2所示。

表2 22種獸藥的保留時間、監(jiān)測離子對（*定量離子）以及質譜參數Table 2Retention time，monitor ion pairs and MS conditions of twety two drugs（*quantification ions）

續(xù)表2 22種獸藥的保留時間、監(jiān)測離子對（*定量離子）以及質譜參數Continue table 2Retention time，monitor ion pairs and MS conditions of twety two drugs（*quantification ions）

1.3.2.3 UPLC-MS/MS測定

根據22種獸藥的類別，磺胺類藥物和喹諾酮類藥物分別以13C6-磺胺二甲嘧啶和D5-諾氟沙星作為內標，以內標法定量，而四環(huán)素類藥物則以空白基質稀釋標準曲線進行外標法定量。

2 結果與分析

2.1 EDTA的選擇

2.2 緩沖液的選擇

在國內外的文獻研究[12-13]中，QuEChERS的提取過程中也常常使用緩沖體系確保某些對pH敏感藥物的提取效率。本研究所涉及的四類藥物中，磺胺和喹諾酮都屬于兩性物質，在1%乙酸乙腈和乙酸鈉構成的緩沖體系中均成離子狀態(tài)，易于被乙腈萃取[11]。試驗中我們比較了乙酸鈉添加與否的情況，結果顯示，在緩沖溶液的提取下，目標藥物大都提取效率提高，如恩諾沙星，我們可以發(fā)現應用緩沖體系后，恩諾沙星的峰高相應提高了50%左右，故我們選擇在提取溶液中添加乙酸鈉，利用緩沖體系提高獸藥在QuEChERS方法中的萃取率。

2.3 鹽析試劑的選擇

在QuEChERS過程中，鹽析試劑的加入主要是為了去除有機相中的部分水分，改變水溶液的極性，促使目標物更多地從水相轉移到有機相，同時利用無水硫酸鎂吸水同時所產生的熱量，促進某些藥物的萃取[1]。由于無水硫酸鎂的吸水性能在一系列鹽類中是較高的，所以其一直是QuEChERS方法中常用的鹽析劑。但由于本研究中四環(huán)素類藥物易與Mg2+發(fā)生螯合反應，盡管EDTA溶液可以抑制反應的比例，但仍然有一部分四環(huán)素會與硫酸鎂反應，所以本研究對無水硫酸鎂和無水硫酸鈉分別充當鹽析劑進行了比較研究。圖1顯示了奶粉中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素在不同鹽析劑作用下的提取效果。

圖1 奶粉中分別使用無水Na2SO4和無水Mg2SO4作為鹽析劑時四環(huán)素類藥物的峰強度比較Fig.1 The comparison of the peak intensity of tetracyclines using anhydrous Na2SO4and anhydrous Mg2SO4as salting-out agent respectively in the matrix of milk powder.

從圖1可以發(fā)現，使用無水硫酸鈉時四環(huán)素類藥物的提取效率優(yōu)于無水硫酸鎂。但在溶液分層效果上，無水硫酸鎂常?？梢缘玫浇缑媲逦挠袡C相層，而無水硫酸鈉則有時出現乳化層。為了改變這種現象，我們每次實驗前均對無水硫酸鈉進行500℃～600℃烘烤16 h以上的處理，則乳化現象得到了有效的抑制。所以最終本研究的鹽析試劑選擇為無水硫酸鈉。

2.4 凈化材料的比較

在QuEChERS方法中，用PSA進行分散固相萃?。╠SPE）凈化主要是利用伯仲胺鍵的極性作用和陰離子交換作用去除來自基質的共萃物中的脂質和糖類等[1]。但由于奶粉和牛奶中基質成分與植物產品等有較大的區(qū)別，故試驗中我們對多種不同的凈化材料進行了比較。

圖2 奶粉中添加5 ng/g典型獸藥后采用不同凈化材料進行QuEChERS提取的效果Fig.2 The effect of QuEChERS extraction of typical veterinary drugs at the concentration of 5 ng/g spiked in milk powder using different d-SPE materials

從圖2中可以發(fā)現，除了酸性氧化鋁凈化時，回收率小于80%之外，其余吸附材料的凈化效果與不使用吸附劑凈化（no-dSPE）的區(qū)別不大，回收率均在80%～120%之間。這一結果說明在本研究所選擇的檢測方法——串聯質譜法對于特異性檢測而言十分有效，進一步的去雜凈化對于質譜檢測的結果并沒有明顯的影響，所以考慮到簡化前處理步驟的需要，本研究不作d-SPE處理，直接氮吹、復溶、過膜檢測。

2.5 標準曲線的測定以及檢測低限的確定

以0.1%甲酸水/乙腈（9∶1）配制磺胺和喹諾酮的系列混合標準溶液，濃度分別為0、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL，其中每個點的13C6-磺胺二甲嘧啶含量為50 ng/mL，D5-諾氟沙星的含量均為100 ng/mL。另外以空白奶粉和牛奶進行QuEChERS提取，制備基質提取溶液，并以該溶液配置四環(huán)素類藥物的系列混合標準溶液，濃度分別為0、25.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL。依次進行超高效液相色譜-串聯質譜測定，計算標準曲線。結果顯示標準曲線線性良好，相關系數均大于0.99。

根據標準溶液在儀器上的響應（3S/N）和樣品中的基質效應以及目前國內外對上述獸藥的殘留限量，本研究將方法的定量限（LOQ）定為磺胺類藥物為1μg/kg，喹諾酮類藥物為5 μg/kg，四環(huán)素類藥物為50 μg/kg。

2.6 添加回收實驗

分別在脫脂奶粉和全脂奶粉中添加LOQ和5倍LOQ添加量的混合標準物質，即1.0、2.0μg/kg的9種磺胺標準，5.0、10.0μg/kg的9種喹諾酮和50.0、100.0μg/kg的四環(huán)素標準，按照上述優(yōu)化結果進行QuEChERS提取檢測。

在具體實驗過程中，全脂奶粉的脂肪并未對實驗操作造成明顯的影響，只要無水硫酸鈉經過500℃～600℃的預處理，液液分層的效果與脫脂奶粉并無差別。結果見表3。

表3 全脂奶粉和脫脂奶粉中添加LOQ及5×LOQ的混合標準溶液的回收Table 3 Recovery of mixed standard at the concentration of LOQ and 5xLOQ spiked in full cream milk powder and skimmed milk powder.

續(xù)表3 全脂奶粉和脫脂奶粉中添加LOQ及5×LOQ的混合標準溶液的回收Continuetable3 RecoveryofmixedstandardattheconcentrationofLOQand5×LOQspikedinfullcreammilkpowderandskimmedmilkpowder

當添加量為上述值時，22種獸藥的回收率為71.05%～102.8%，RSD為3.69%～11.57%，滿足分析要求（70%～110%，RSD<17%）。

3 結論

從上述實驗結果可知，由經過優(yōu)化的QuEChERS處理技術在脫脂奶粉和全脂奶粉中均可以較好地完成磺胺、喹諾酮以及四環(huán)素等3大類22種獸藥的提取，其檢測低限分別可達1 μg/kg（磺胺）、5 μg/kg（喹諾酮）和50 μg/kg（四環(huán)素），回收率及精密度均符合分析要求。與常規(guī)的QuEChERS方法相比，本研究所改進的方法增加了EDTA和緩沖體系的組合提取過程，擴展了QuEChERS方法所能適應的獸藥種類，實現了不同類別獸藥的多殘留QuEChERS提取。并且，由于d-SPE步驟的省略，進一步簡化了QuEChERS方法的操作步驟，使牛奶和奶粉中QuEChERS方法提取獸藥的過程更加簡捷，具有更大的應用性。

本研究驗證了改進后的QuEChERS方法對奶制品中多類獸藥的提取有效性，建立了奶粉中殘留獸藥（磺胺、喹諾酮和四環(huán)素）的QuEChERS提取-超高效液相色譜-串聯質譜檢測技術，其在獸藥殘留分析中有著較大的應用前景。

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Applied Research on QuEChERS Using to Determine Veterinary Drugs Residues in Milk Powder

MI Jie-bo1，XU Di-ming2，LI Shu-jing1，LIN An-qing1，XU Hong1

（1.Animal&Plant&Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Import&Export Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.Ningbo Import&Export Inspection and Quarantine Bureau，Ningbo 315000，Zhejiang，China）

QuEChERS was modified by the optimization of extract solution and salting-out agents.A simple，fast and selective method was developed to determine 22 veterinary drugs in milk powder by ultra-high pressure liquid chromatography coupled to tandem quadrupole mass spectrometry.The extraction of sulphonamides，quinolones and tetracyclines was optimized by using EDTA and buffer system.The limits of detection of sulphonamides，quinolones and tetracyclines were 1，5 μg/kg and 50 μg/kg.When the standards mixture was spiked，the recovery was 70%-102%and the RSD was less than 15%.

QuEChERS；milk powder；veterinary drug residues

2013-09-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.030

天津檢驗檢疫科技計劃項目（TK005-2011）

宓捷波（1978—），男（漢），高級工程師，博士研究生，從事食品及農獸藥殘留分析。