張發(fā)宇，趙冰冰，蔡靜，袁夢(mèng)媛，盛晶夢(mèng)，汪家權(quán)*

鹽析法純化新鮮藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白工藝條件的研究

張發(fā)宇1，趙冰冰1，蔡靜2，袁夢(mèng)媛1，盛晶夢(mèng)1，汪家權(quán)1*

1.合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥230009 2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009

以水華暴發(fā)的新鮮藍(lán)藻為處理對(duì)象，采取凍融破壁的方式獲取藻藍(lán)蛋白的粗提液。在一步鹽析與二步鹽析單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，基于正交試驗(yàn)綜合考慮鹽析時(shí)間、藻藍(lán)蛋白的濃度、pH和（NH4）2SO4飽和度對(duì)純化藻藍(lán)蛋白的影響。結(jié)果表明，一步鹽析中最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為17%、藻藍(lán)蛋白粗提液濃度為1.45 g/L、pH為6.4、鹽析時(shí)間為15 min；二步鹽析中最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為35%、pH為4.0、鹽析時(shí)間為15min。最終能得到純度為2.04的藻藍(lán)蛋白，有利于藻藍(lán)蛋白的進(jìn)一步純化。

鹽析；純化；藻藍(lán)蛋白；正交試驗(yàn)

張發(fā)宇，趙冰冰，蔡靜，等.鹽析法純化新鮮藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白工藝條件的研究［J］.環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，5（6）：499-503.

ZHANG F Y，ZHAO B B，CAIJ，et al.Research on technology conditions of purifying phycocyanin from fresh algae using salt precipitation［J］.Journal of Environmental Engineering Technology，2015，5（6）：499-503.

富營(yíng)養(yǎng)化是指由于人類的活動(dòng)，水體中營(yíng)養(yǎng)物（一般是氮、磷的化合物）增加，引起浮游植物過(guò)量生長(zhǎng)和整個(gè)水體生態(tài)平衡的改變，因而造成危害的一種污染現(xiàn)象［1］。其結(jié)果是引起水質(zhì)惡化、溶解氧耗竭、透明度降低、漁業(yè)減產(chǎn)、阻塞航道，對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生毒性等。這種現(xiàn)象在江河湖泊中稱為水華［2］。

湖泊水華的直接表現(xiàn)是浮游植物即藍(lán)藻的大面積暴發(fā)。針對(duì)藍(lán)藻暴發(fā)，一般采取機(jī)械和人工的方式進(jìn)行打撈，但打撈后的藍(lán)藻如果處置不當(dāng)會(huì)造成二次污染，因此，針對(duì)打撈后的藍(lán)藻進(jìn)行資源化研究具有重要意義。目前，藍(lán)藻資源化利用方式主要以產(chǎn)沼氣和肥料為主［3-6］，產(chǎn)品附加值較低，經(jīng)濟(jì)效益不高。研究表明，藍(lán)藻中含有一種天然色素蛋白——藻藍(lán)蛋白；該蛋白具有良好的功效，如抗炎性［7］、抗癌性［8］、抗衰老性［9］、抗氧化性［10-11］、免疫熒光性［12-13］等；該蛋白純度越高價(jià)值越大。因此，從藍(lán)藻中提取藻藍(lán)蛋白，是藍(lán)藻高附加值資源化利用的方向，也更符合目前經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展需求。研究［14］表明，藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到0.7以上，可作為食品級(jí)使用；純度達(dá)到2以上，可作為藥品級(jí)使用；純度達(dá)到4以上，可作為試劑級(jí)使用。可見，從水華暴發(fā)的藍(lán)藻中純化藻藍(lán)蛋白既能達(dá)到消除污染的目的，又可實(shí)現(xiàn)高附加值資源化利用。

純化藻藍(lán)蛋白的研究較多［15-19］，筆者選擇以反復(fù)凍融破壁的方式獲得藻藍(lán)蛋白粗提液，重點(diǎn)研究鹽析法純化藻藍(lán)蛋白的基本工藝條件。選取鹽析法純化藻藍(lán)蛋白是因?yàn)樵摲ň哂袘?yīng)用成熟、材料來(lái)源廣泛、易于工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)研究鹽析工藝一般都基于較粗放的不同飽和度（NH4）2SO4的單因素試驗(yàn)［20］，對(duì)運(yùn)用0.618法精確選取合適（NH4）2SO4飽和度范圍以及兩步鹽析中各因素之間關(guān)系的研究較少。另外，對(duì)影響鹽析的各要素之間關(guān)系的研究也很少。因此，筆者在一步和二步鹽析單因素試驗(yàn)中運(yùn)用0.618法精確選取合適（NH4）2SO4飽和度范圍的基礎(chǔ)上，建立起兩步鹽析中相關(guān)因素的正交試驗(yàn)，得到鹽析法純化藻藍(lán)蛋白的優(yōu)化條件，并通過(guò)鹽析法獲得純度較高的藻藍(lán)蛋白，以期為后期進(jìn)一步的純化提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮藍(lán)藻采自巢湖西湖區(qū)水華暴發(fā)表層20 cm水體，含水率為96.2%，采樣日期為2014年8月9日，采樣期間天氣晴朗，室外氣溫37～38℃。藍(lán)藻采集后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室放入冰柜（BC/BD-718DTF型）內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆?，存?chǔ)溫度為-18℃。

硫酸銨（（NH4）2SO4）、硫酸（H2SO4）、氫氧化鈉（NaOH）均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，自配濃度?.002 5 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1提取藻藍(lán)蛋白粗提液

取冷凍保存的巢湖新鮮水華藍(lán)藻，反復(fù)凍融3次。將解凍后的藍(lán)藻于高速冷凍離心機(jī)（KDC-160HR型）中離心20 min，上清液過(guò)4層普通紗布，即可得到藻藍(lán)蛋白粗提液。

1.2.2兩步鹽析及正交試驗(yàn)

在（NH4）2SO4飽和度為10%～60%范圍內(nèi)，根據(jù)0.618法的原理進(jìn)行一步鹽析，步驟如下：在已取得的藻藍(lán)蛋白粗提液中緩慢加入（NH4）2SO4，用恒溫?cái)嚢杵鳎?5-2A型）進(jìn)行攪拌，以防止溶液局部濃度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。（NH4）2SO4飽和度分別調(diào)至17%、19%、20%、21%、22%、24%、29%和41%，共8組。（NH4）2SO4經(jīng)攪拌溶解后，在4℃、8 00 0 r/min高速冷凍離心機(jī)中離心10 min，倒出上清液，用紫外-可見分光光度儀（UV/VIS-1950型）測(cè)定藻藍(lán)蛋白純度，并計(jì)算得率。

在第一步鹽析試驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮（NH4）2SO4飽和度、藻藍(lán)蛋白的初始濃度、pH和鹽析時(shí)間的影響，優(yōu)選一步鹽析中因素與水平，建立正交試驗(yàn)。

同樣，在（NH4）2SO4飽和度為21%～70%范圍內(nèi)，根據(jù)0.618法的原理進(jìn)行二步鹽析，步驟如下：將藻藍(lán)蛋白粗提液在一步鹽析的（NH4）2SO4最優(yōu)飽和度下鹽析后，取適量上清液，向其中追加（NH4）2SO4，至其飽和度分別達(dá)到 28.16%、29.28%、29.80%、30.40%、30.92%、32.56%、35.32%、39.72% 和 51.28%，共 9組。加 入（NH4）2SO4后，經(jīng)恒溫?cái)嚢杵鲾嚢枞芙猓?℃、8 000 r/min高速冷凍離心機(jī)中離心10 min，獲得沉淀，沉淀用磷酸緩沖溶液（0.002 5 mol/L的PBS）溶解后，用紫外-可見分光光度儀測(cè)定藻藍(lán)蛋白純度，并計(jì)算得率。

在二步鹽析試驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮（NH4）2SO4飽和度、pH和鹽析時(shí)間的影響，優(yōu)選二步鹽析中因素與水平，建立正交試驗(yàn)。

1.3分析方法

藻藍(lán)蛋白在620 nm處有特征吸收峰，蛋白在280 nm處有最大吸收峰，藻藍(lán)蛋白的純度測(cè)量參考A.Herrera等［21］推薦的公式。藻藍(lán)蛋白濃度、得率參考B.Soni等［22］推薦的公式。

藻藍(lán)蛋白純度（P）=A620/A280

藻藍(lán)蛋白濃度（C）=（A620-0.7×A650）/7.38

藻藍(lán)蛋白得率=（C×V×k1）/（m×k2×1 000）×100

式中：A280、A620、A650分別為波長(zhǎng)280、620和650 nm處的吸光度；C為蛋白濃度，g/L；V為藻藍(lán)蛋白體積；m為藻泥質(zhì)量；k1為藻藍(lán)蛋白稀釋倍數(shù)；k2為藻泥中藍(lán)藻干物質(zhì)所占比例。

2　結(jié)果與討論

2.1一步鹽析（NH4）2SO4飽和度單因素試驗(yàn)

將1.2.1節(jié)中所取得的藻藍(lán)蛋白粗提液（初始純度為0.426），在室溫（25℃）下，按1.2.2節(jié)步驟并依據(jù)0.618法選點(diǎn)原理進(jìn)行試驗(yàn)，在（NH4）2SO4飽和度為17%、19%、20%、21%、22%、24%、29%、41%下，分別測(cè)定上清液中藻藍(lán)蛋白純度和得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1　一步鹽析（NH4）2SO4飽和度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度與得率的影響Fig.1　Effect of different（NH4）2SO4saturation on phycocyanin purity and yield of the first salt precipitation（25℃）

由圖1可見，在（NH4）2SO4飽和度為21%時(shí)，藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到最大，為0.519。在（NH4）2SO4飽和度為17%～24%時(shí)，得率變化不明顯。但當(dāng)（NH4）2SO4飽和度大于29%后，純度與得率均有較大程度下降。因此，一步鹽析中選?。∟H4）2SO4飽和度最優(yōu)點(diǎn)為21%，一步鹽析（NH4）2SO4飽和度為17%～24%較合適。

2.2一步鹽析正交試驗(yàn)

在一步鹽析（NH4）2SO4飽和度單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮（NH4）2SO4飽和度、藻藍(lán)蛋白濃度、pH和鹽析時(shí)間的影響，按照L9（43）建立正交試驗(yàn)。影響因素及水平見表1。將正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果見表2。

表1　一步鹽析正交試驗(yàn)影響因素及水平Table1　Factors and levels of orthogonal experimentof the first salt precipitation

表2　一步鹽析正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果Table 2　Results of orthogonal experiment of the first salt precipitation

由表2可知，各影響因素對(duì)純度的重要性依次為pH＞鹽析時(shí)間＞（NH4）2SO4飽和度＞藻藍(lán)蛋白濃度。pH影響最大，酸性和堿性環(huán)境對(duì)一步鹽析中藻藍(lán)蛋白的純化均有影響，在一定程度上會(huì)導(dǎo)致上清液中藻藍(lán)蛋白純度下降，原水環(huán)境（pH=6.4）是一步鹽析純化藻藍(lán)蛋白最優(yōu)環(huán)境。在（NH4）2SO4飽和度為17%～25%時(shí)，鹽析時(shí)間、（NH4）2SO4飽和度影響較弱，如果（NH4）2SO4飽和度較高，鹽析時(shí)間可減少，也會(huì)有良好的純化效果。藻藍(lán)蛋白濃度影響最弱，在低濃度的藻藍(lán)蛋白溶液下，基本上可以不考慮其濃度變化的影響。綜合表2可知，在室溫（25℃）下，一步鹽析最優(yōu)的工藝條件：（NH4）2SO4飽和度為17%，藻藍(lán)蛋白濃度為1.45 g/L，pH為6.4（即原水pH），鹽析時(shí)間為15 min。

2.3二步鹽析（NH4）2SO4飽和度單因素試驗(yàn)

根據(jù)一步鹽析試驗(yàn)結(jié)果，在室溫25℃下，精細(xì)追加（NH4）2SO4，至其飽和度分別為 28.16%、29.28%、29.80%、30.40%、30.92%、32.56%、35.32%、39.72%和51.28%，得到的藻藍(lán)蛋白沉淀經(jīng)溶解后測(cè)藻藍(lán)蛋白純度和得率見圖2。

圖2　二步鹽析不同飽和度（NH4）2SO4對(duì)藻藍(lán)蛋白純度與得率的影響Fig.2　Effect of different（NH4）2SO4saturation on phycocyanin purity and yield of the second salt precipitation

由圖2可見，二步鹽析時(shí)，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度為28.16%～29.80%，沉淀中藻藍(lán)蛋白的純度和得率均呈上升趨勢(shì)，在（NH4）2SO4飽和度為29.80%時(shí)，沉淀中藻藍(lán)蛋白的純度和得率分別達(dá)到最大值，為1.969和2.95%。當(dāng)（NH4）2SO4飽和度大于29.80%時(shí)，純度開始下降，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度大于30.92%時(shí)，純度下降開始明顯，但得率變化并不明顯。因此，二步鹽析中選?。∟H4）2SO4的飽和度最優(yōu)值為 29.80%，（NH4）2SO4飽和度為29.28%～35.32%較合適。

2.4二步鹽析正交試驗(yàn)

在第二步鹽析單因素試驗(yàn)與一步鹽析正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行二步鹽析的正交試驗(yàn)?？紤]到藻藍(lán)蛋白濃度影響最小，并且在實(shí)際中調(diào)節(jié)不便，因此二步鹽析正交試驗(yàn)重點(diǎn)考慮（NH4）2SO4飽和度、pH和鹽析時(shí)間的影響，不考慮藻藍(lán)蛋白濃度因素。按照L9（43）建立正交試驗(yàn)，影響因素及水平如表3所示。正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果見表4。

表3　二步鹽析正交試驗(yàn)影響因素及水平Table 3　Factors and levels of orthogonal experiment of the second salt precipitation

表4　二步鹽析正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果Table 4　Results of orthogonal experiment of the first salt precipitation

由表4可以看出，各影響因素對(duì)純度的重要性為（NH4）2SO4飽和度 ＞pH＞鹽析時(shí)間。在（NH4）2SO4飽和度為25%～35%時(shí)，（NH4）2SO4飽和度影響最大，隨著（NH4）2SO4飽和度的增加，沉淀中藻藍(lán)蛋白純度增大。pH影響次之，酸性環(huán)境明顯優(yōu)于原水和堿性環(huán)境，這是因?yàn)樵逅{(lán)蛋白的等電點(diǎn)在弱酸性（pH為4）附近，該環(huán)境利于藻藍(lán)蛋白沉淀析出。鹽析時(shí)間影響最弱，可以不考慮其影響，只需保證二步鹽析中（NH4）2SO4完全溶解即可，因此選定鹽析時(shí)間為15 min。綜合表4可知，在室溫（25℃）下，二步鹽析最優(yōu)工藝條件：（NH4）2SO4飽和度為35%，pH為4，鹽析時(shí)間為15 min。

2.5兩步鹽析最優(yōu)工藝條件試驗(yàn)

在一步與兩步鹽析的正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行最優(yōu)工藝條件試驗(yàn)：在一步鹽析中選?。∟H4）2SO4飽和度為17%，藻藍(lán)蛋白濃度為1.45 g/L，pH為6.8（即鹽析時(shí)間為 15 min；在二步鹽析中選?。∟H4）2SO4飽和度為35%，pH為6.8（工程應(yīng)用上盡量不調(diào)節(jié)pH），鹽析時(shí)間為15 min時(shí)，藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到2.04。

3　結(jié)論

（1）鹽析法用于純化藻藍(lán)蛋白有良好的效果，一般需要進(jìn)行兩步鹽析組合試驗(yàn)，一步鹽析時(shí)較低（NH4）2SO4飽和度利于除去雜質(zhì)，二步鹽析時(shí)較高（NH4）2SO4飽和度利于沉淀更多的藻藍(lán)蛋白。

（2）一步鹽析中（NH4）2SO4飽和度合適區(qū)間為17%～24%，二步鹽析中（NH4）2SO4飽和度合適區(qū)間為29.28%～35.32%。

（3）一步鹽析最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為17%，藻藍(lán)蛋白濃度為1.45 g/L，pH為6.4，鹽析時(shí)間為15 min；二步鹽析最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為35%，pH為4，鹽析時(shí)間為15 min。

（4）在最優(yōu)工藝條件下試驗(yàn)，最終可得純度大于2的藻藍(lán)蛋白，為后期進(jìn)一步純化提供了基礎(chǔ)。

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Research on Technology Conditions of Purifying Phycocyanin from Fresh A lgae Using Salt Precipitation

ZHANG Fa-yu1，ZHAO Bing-bing1，CAI Jing2，YUAN Meng-yuan1，SHENG Jing-meng1，WANG Jia-quan1
1.School of Resources and Environmental Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China 2.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China

The fresh blue-green algae in algae bloom were used for treatment and the crude extracts of phycocyanin were obtained by freeze-thaw method.On the basis of single-factor experiment of salt precipitation in the first and second steps，salt precipitation time，the impacts of phycocyanin concentration，pH and（NH4）2SO4saturation on the purifying phycocyanin were comprehensively considered using the orthogonal experiment.The results showed that the optimum conditions in the first step were 17%of（NH4）2SO4saturation，1.45 g/L of crude phycocyanin extract，pH 6.4 and 15 min of reaction time.In the second step，the optimum（NH4）2SO4saturation was 35%，with pH 4.0 and 15min of reaction time.The purity of phycocyanin was2.04 at last，which would facilitate further purification.

salt precipitation；purification；phycocyanin；orthogonal experiment

X703

1674-991X（2015）06-0499-05doi：10.3969/j.issn.1674-991X.2015.06.078

2015-06-21

國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2012ZX07103-004）

張發(fā)宇（1983—），男，講師，博士，主要研究方向?yàn)樗幚砑夹g(shù)，13655551436@139.com

*責(zé)任作者：汪家權(quán)（1957—），男，教授，博士，主要從事環(huán)境系統(tǒng)仿真與污染控制、環(huán)境規(guī)劃管理及水資源利用與保護(hù)，jiaquan.wang@163.com