張曉雯，崔 靜，李 良

(首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理系， 北京 100069)

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研究論文

低氧對SH-SY5Y細(xì)胞miR- 124及BACE1蛋白表達(dá)的影響

張曉雯，崔 靜，李 良*

(首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理系， 北京 100069)

目的研究低氧對培養(yǎng)細(xì)胞miR- 124及β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)蛋白表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)，分為對照組、氧-糖剝奪組、Aβ1-42處理組、過表達(dá)或抑制miR- 124組，用實時定量PCR方法檢測miR- 124表達(dá)，Western blot 法檢測BACE1蛋白表達(dá)。結(jié)果氧-糖剝奪處理48 h，細(xì)胞內(nèi)miR- 124表達(dá)水平明顯下降，僅為對照組的46.9%(P<0.05)，BAE1蛋白表達(dá)水平與較對照組增高36 %(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR- 124過表達(dá)組組細(xì)胞內(nèi)miR- 124表達(dá)水平較對照組增高245倍(P<0.01)，為miR- 124過表達(dá)對照組的219倍(P<0.01)，BACE1蛋白表達(dá)水平較對照組下降了29%(P<0.05)，較miR- 124過表達(dá)對照組下降25%(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR- 124抑制劑組miR- 124表達(dá)水平下降至對照組的45.4%(P<0.05)，至miR- 124抑制對照組的48%(P<0.05)，BACE1表達(dá)水平較對照組升高21%(P<0.05)，較miR- 124抑制對照組升高40.3%(P<0.01)；細(xì)胞經(jīng)Aβ1-42處理24 h，miR- 124表達(dá)水平較對照組下降52%(P<0.05)，BACE1蛋白表達(dá)水平較對照組增高51%(P<0.05)。結(jié)論低氧通過降低SH-SY5Y細(xì)胞miR- 124表達(dá)進(jìn)而升高BAEC1蛋白表達(dá)，且可能在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)早期發(fā)病中發(fā)揮作用。

低氧；miR- 124；β-淀粉樣蛋白(Aβ)；β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)

缺血/低氧(ischemia /hypoxia)是機(jī)體常見的一種損傷原因，慢性腦缺血/低氧是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病的危險因素之一[1]。AD發(fā)病機(jī)制之一是β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid，Aβ)沉積，Aβ是由β-淀粉樣肽前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)經(jīng)β-分泌酶(β-Amyloid precursor protein cleavage enzyme 1，BACE1) 和γ-分泌酶共同切割形成[2]。因此BACE1在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

MicroRNA (miRNA)是一類非編碼小分子單鏈RNA，可作用于靶mRNA3′-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。有報道表明，在AD患者的腦組織內(nèi)，miR- 124表達(dá)水平下降[3]。生物信息學(xué)網(wǎng)站(target scan和pictar)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BACE1可能是miR- 124調(diào)控的靶蛋白。本研究采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y)，觀察低氧對miR- 124及其下游BACE1蛋白表達(dá)的影響，同時觀察Aβ是否對miR- 124有調(diào)控作用，闡明缺血/低氧在AD早期發(fā)病中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SH-SY5Y細(xì)胞(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所)，胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，Aβ1-42(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)miR- 124 mimic、miR- 124 mimic control、miR- 124抑制劑、miR- 124抑制劑對照組(廣州銳博生物科技有限公司)，Lipo2000(Invitrogen公司)，miRNA提取試劑盒(MACHEREY-NAGEL公司)，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green master mix，miR- 124 primer(Exiqon公司)，兔抗BACE1單克隆抗體(Cell Signaling公司)，鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒，ECL發(fā)光試劑盒(Pierce公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：SH-SY5Y細(xì)胞在含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖(葡萄糖25 mmol/L)培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為對照組，氧-糖剝奪處理組，Aβ1-42處理組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染組。

1.2.2 氧-糖剝奪處理：低氧模型組細(xì)胞進(jìn)行氧-糖剝奪(oxygenglucose deprivation，OGD)處理。DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖2.78 mmol/L)，2% O2條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 Aβ1-42處理：Aβ1-42預(yù)先置于37 ℃環(huán)境下孵育72 h，使用Aβ1-42(20 μmol/L)處理24 h后收集細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1天將SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板中，接種量1.5×109個/L。按試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR- 124 mimic、miR- 124 mimic control 用量50 nmol/L，miR- 124抑制劑、miR- 124抑制劑對照組用量100 nmol/L。培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.2.5 實時定量PCR(Q-PCR)：使用miRNA提取試劑盒提取細(xì)胞miRNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNAs，將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNAs稀釋80倍，進(jìn)行Q-PCR(CFX Connect Optics Module)。所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。實驗采用RNU5G作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。

1.2.6 Western blot 檢測：參照文獻(xiàn)[4]制備電泳蛋白樣品進(jìn)行電泳。使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司，F(xiàn)luorChem FC3)曝光。應(yīng)用ImageJ 軟件進(jìn)行半定量分析，計算各蛋白條帶總吸光度A值與相應(yīng)內(nèi)參總吸光度A值的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧處理使miR- 124的表達(dá)水平下降，BACE1表達(dá)水平升高

與對照組相比，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)低氧處理48 h后，miR- 124表達(dá)水平明顯下降，僅為對照組的46.9%(P<0.01)(圖1A)，同時，BACE1表達(dá)水平明顯上升，增高至對照組的1.36倍(P<0.05)(圖1B,C)。

2.2 miR- 124調(diào)控BACE1的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)75%左右(圖2A)。轉(zhuǎn)染miR- 124過表達(dá)組48 h后細(xì)胞內(nèi)miR- 124表達(dá)水平明顯升高，為對照組的245倍(P<0.01)，為miR-124過表達(dá)對照組的219倍(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)BACE1表達(dá)水平較對照組下降了29%(P<0.05)，較miR-124過表達(dá)對照組下降25%(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR- 124抑制劑組48 h后，miR- 124表達(dá)水平下降至對照組的45.4%(P<0.05)，下降至miR-124抑制劑對照組的48%，BACE1表達(dá)水平較對照組升高21%(P<0.05)，較miR-124抑制劑對照組升高40.3%(P<0.01)(圖2B～D)。

2.3 Aβ1-42處理可使miR- 124的表達(dá)水平下降，BACE1表達(dá)水平升高

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Aβ1-42處理24 h后，miR- 124表達(dá)水平較對照組下降52%(P<0.05)(圖3A)，BACE1表達(dá)水平較對照組升高51%(P<0.05)(圖3B,C)。

3 討論

miRNA是一類長約22 nt的非編碼RNA，近年來miRNA在疾病發(fā)生過程中所發(fā)揮的作用得到人們的廣泛重視。研究表明，在AD的發(fā)病過程中，miRNA也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。檢測AD患者腦內(nèi)海馬區(qū)miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR- 124的表達(dá)水平較正常成人對照組有所下降，提示miR- 124在AD發(fā)病過程中可能存在的調(diào)控作用。采用Target Scan等生物信息學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR- 124與BACE1的3′UTR區(qū)存在潛在的結(jié)合位點。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR- 124可以使BACE1表達(dá)水平降低，而抑制miR- 124的表達(dá)則可以使BACE1表達(dá)水平升高，說明miR- 124對BACE1的表達(dá)具有調(diào)控作用。該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[5]。

腦缺血是AD發(fā)病的危險因素之一，影像研究表明AD患者局部腦血流灌注明顯下降。采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(2-vessel occlusion, 2-VO)法制備腦血流低灌注大鼠模型，術(shù)后7 d動物即出現(xiàn)空間記憶損害[6]。除此之外，越來越多的研究表明，低氧可以導(dǎo)致miRNA表達(dá)水平的改變。研究報道，在大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠腦組織中，miR- 145、miR- 206、miR- 331等19種miRNA表達(dá)水平上調(diào)，miR- 29b，miR- 137，miR- 335等14種miRNA表達(dá)水平下降[7- 8]。腦缺血損傷72 h后，miR- 210表達(dá)水平上升[9]。本研究顯示，低氧處理48 h后，SH-SY5Y細(xì)胞miR- 124表達(dá)水平下降，BACE1表達(dá)水平上升。

A.relative quantity of miR- 124; B,C.Western blot and statistical analysis of BACE1 protein levels;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

圖1 低氧處理48 h后SH-SY5Y細(xì)胞miR- 124及BACE1的表達(dá)

A.SH-SY5Y cells were treated with micrONTM mimic negative control (Cy3) (Scale bar = 20 μmol/L); B.relative quantity of miR- 124; C, D.Western blot and statistical analysis of BACE1 protein levels;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with miRNA control group

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)miR- 124及BACE1的表達(dá)

A.relative quantity of miR- 124; B, C.Western blot and statistical analysis of BACE1 protein levels;*P<0.05 compared with control group

圖3 Aβ1-42處理24 h后SH-SY5Y細(xì)胞miR- 124及BACE1的表達(dá)

說明低氧可以通過影響miR- 124的表達(dá)最終影響B(tài)ACE1的表達(dá)，提示著miR- 124在缺血/低氧導(dǎo)致AD發(fā)病的過程中也許發(fā)揮著重要的作用。

Aβ是AD主要病理特征老年斑的主要成分。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中Aβ假說目前得到了科學(xué)家們的廣泛認(rèn)可。Aβ可破壞突觸結(jié)構(gòu)，損害海馬區(qū)的長時程增強(qiáng)作用，引起學(xué)習(xí)記憶功能下降；可誘導(dǎo)炎性級聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙[10- 11]。本實驗結(jié)果顯示，Aβ1-42處理24 h后，SH-SY5Y細(xì)胞miR- 124表達(dá)水平下降，BACE1表達(dá)水平增高。提示Aβ1-42能夠通過miR- 124進(jìn)一步影響B(tài)ACE1的表達(dá)。

以上結(jié)果表明，低氧和Aβ均可以誘導(dǎo)miR- 124和BACE1表達(dá)水平的變化。低氧能夠?qū)е耺iR- 124表達(dá)水平下降，同時BACE1表達(dá)水平上升，BACE1表達(dá)水平的上升可導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生增多。Aβ又能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)miR- 124表達(dá)水平下降，BACE1表達(dá)水平上升。如此循環(huán)往復(fù)，形成惡性循環(huán)。由此可見，miR- 124在低氧導(dǎo)致AD的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。

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新聞點擊

濫用抗生素的后果愈發(fā)明顯

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年9月18日報道，新研究指出濫用抗生素的后果：美國每年至少有200萬人感染抗藥性細(xì)菌，并且有23 000人因此死亡。美國疾病控制暨預(yù)防中心(CDC)表示，這項數(shù)據(jù)只是保守估計，因為數(shù)據(jù)僅來自醫(yī)院紀(jì)錄，并不包括安養(yǎng)院或其他醫(yī)療單位的感染病例。

研究人員認(rèn)為，在研究案例中，高達(dá)半數(shù)的抗生素使用為非必要、甚至不恰當(dāng)，像是病毒感染使用抗生素治療就不恰當(dāng)。這份報告也警告，研發(fā)的新型抗生素數(shù)量未能符合短期需求，有效治療已快要用罄。

CDC主任佛利登(Tom Frieden)說：“如果我們再不謹(jǐn)慎的話，我們很快就會進(jìn)入無藥可用的后抗生素時代?！?/p>

佛利登說：“其實對某些患者與細(xì)菌來說，已經(jīng)是后抗生素時代。缺乏有效治療不僅會破壞我們對抗一般感染的能力，也會造成嚴(yán)重并發(fā)癥，對已經(jīng)罹患其他疾病的患者來說影響更嚴(yán)重?！?/p>

Effects of hypoxia on the expressions of miR- 124 and BACE1 protein in SH-SY5Y cells

ZHANG Xiao-wen, CUI Jing, LI Liang*

(Dept. of Pathology, School of Basic Medicine Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

Objective To investigate the role of hypoxia on the expression of miR- 124 and BACE1. MethodsCultured SH-SY5Y cells were divided into blank control group, oxygen-glucose deprivation (OGD) group, Aβ1-42group and overexpression or inhibition of miR- 124 group. RT-PCR was performed to analyze the expression of miR- 124 level. The level of BACE1 was examined by Western blot. Results After OGD for 48 h, the expression level of miR- 124 decreased significantly to 46.9% of the control group (P<0.05), while the expression level of BACE1 was increased by 36% compared with the control group (P<0.01). After transfection of 48 h, miR- 124 level of miR- 124 mimic group was increased by 245 folds as compared with control (P<0.01) and by 219 folds as compared with miR- 124 mimic control (P<0.01); BACE1 level was decreased by 29% compared with control (P<0.05) and by 25% compared with miR- 124 mimic control (P<0.05); miR- 124 level of miR- 124 inhibitor group was decreased to 45.4% of control (P<0.05), 48% of miR- 124 inhibitor control (P<0.05), BACE1 level was increased by 21% compared with control (P<0.05), 40.3% compared with miR- 124 inhibitor control (P<0.01). miR- 124 level was decreased by 52% compared with control (P<0.05) and the level of BACE1 level was increased by 51% after Aβ1-42treatment for 24 h (P<0.05). Conclusions Hypoxia may increase the expression of BACE1 through the down-regulation of miR- 124 which plays a role in the early pathogenesis of Alzheimer’s disease.

hypoxia; miR- 124; β-Amyloid(Aβ); β-Amyloid precursor protein cleavage enzyme 1(BACE1)

2014- 12- 19

2015- 01- 13

國家自然科學(xué)基金(81070926,81271310)

1001-6325(2015)04-0470-05

R363.1

A

*通信作者(corresponding author)：liliang@ccmu.edu.cn