石 瑤，郭 倩，周也涵，萬 丹，葉秀峰

(重慶醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室 神經(jīng)科學(xué)研究中心， 重慶 400016)

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研究論文

白藜蘆醇通過Sirtuins 1通路促進(jìn)自噬減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷

石 瑤，郭 倩，周也涵，萬 丹，葉秀峰*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室 神經(jīng)科學(xué)研究中心， 重慶 400016)

目的觀察白藜蘆醇(Res)在大鼠局灶性腦缺血/再灌注(I/R)損傷中腦保護(hù)作用與自噬的關(guān)系。方法隨機(jī)將大鼠分成假手術(shù)組(S組)、腦缺血/再灌注模型組(I/R組)、低和高劑量(15和40 mg/kg)Res處理組(R1和R2組)，其中將R2組另設(shè)2個亞組：R2+3-甲基腺嘌呤(3-MA)組和R2+Sirt1抑制劑Sirtinol 組。線栓法構(gòu)建大鼠I/R模型。缺血2 h,再灌注24 h后，用尼氏染色觀察皮質(zhì)區(qū)的組織學(xué)形態(tài)；用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測腦組織的梗死體積；用real-time QPCR和Western blot檢測腦組織中Sirt1和LC3的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果與S組相比，I/R組大鼠可見明顯的腦梗死灶，顯微鏡下見病理損傷改變，自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Sirt1表達(dá)均有上升。Res預(yù)處理后，能明顯減輕I/R大鼠皮質(zhì)區(qū)的病理損傷，減少腦梗死體積(P<0.01)，顯著增加I/R大鼠腦組織中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Sirt1的表達(dá)(P<0.01)；而Sirt1抑制劑及3-MA能削弱Res的作用。結(jié)論Res減輕大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的腦保護(hù)作用可能與Res通過提高Sirt1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)自噬來完成的。

腦缺血/再灌注損傷；白藜蘆醇；自噬；沉默信息調(diào)控因子1

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種廣泛存在于虎杖、葡萄和花生等植物性食物或藥物中的非黃酮類多酚小分子物質(zhì)，具有抗感染、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[1]。本實驗的前期研究結(jié)果表明[2]，Res預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，與文獻(xiàn)[3]報道相符，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)保護(hù)機(jī)制可能與其誘導(dǎo)自噬的發(fā)生有關(guān)。然而，Res是在腦缺血/再灌注損傷中如何誘導(dǎo)激活自噬機(jī)制尚待闡明。

沉默信息調(diào)控因子1(sirtuins 1,Sirt1)是廣泛存在于哺乳動物中NAD+依賴的去乙?；?，有研究發(fā)現(xiàn)Sirt1的表達(dá)及活性上調(diào)能夠誘導(dǎo)自噬的激活[4]，且被認(rèn)為Res是目前為止發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的Sirt1激動劑[5]，在神經(jīng)變性疾病中，Res能通過上調(diào)Sirt1進(jìn)而誘導(dǎo)自噬發(fā)生起到神經(jīng)保護(hù)作用，對延緩神經(jīng)變性疾病進(jìn)展有重要意義[6]。

本實驗旨在探討Res對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷中腦保護(hù)作用與自噬的關(guān)系，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制，找尋藥物作用的靶點，以期為缺血性腦血管疾病的預(yù)防及臨床治療提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

SPF級SD大鼠(雄性)72只，體質(zhì)量250～300 g[重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(渝)2007-0001]。將大鼠隨機(jī)分成4個組：假手術(shù)組(S組，n=16)、腦缺血/再灌注模型組(I/R組，n=16)、低和高劑量(15和40 mg/kg)Res處理組(R1組，n=16和R2組，n=24)，其中將R2組另設(shè)兩個亞組：R2+3-MA組和R2+Sirtinol組。

1.2 藥品與試劑

白藜蘆醇(純度99%，Genview公司)；3-MA、Sirtinol、DMSO和TTC(Sigma公司)；RNAiso Plus、PrimeSriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex Taq?試劑盒(TaKaRa公司)；鼠抗-Sirt1單克隆抗體和兔抗-LC3多克隆抗體(Abcam公司)；兔抗-β-actin多克隆抗體(北京四正柏公司)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京百泰克公司)。蛋白裂解液和凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 大鼠腦缺血/再灌注損傷模型制備及給藥

采用改良的Longa等[7]大腦中動脈內(nèi)線栓阻斷法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立局灶性腦缺血再灌注(I/R)模型，缺血2 h,再灌注24 h。S組：手術(shù)過程同I/R組，但線栓插入深度10 mm即可。R1組和R2組大鼠在用藥前稱重，分別給予Res低和高劑量(15和40 mg/kg)腹腔注射，每天1次，第7天于術(shù)前30 min給藥。S組和I/R組大鼠予以DMSO和0.9%氯化鈉注射液處理，給藥方式及劑量同Res處理組。R2+3-MA組和R2+Sirtinol組大鼠于術(shù)前30 min用微量注射器向右側(cè)腦室(前囟點旁開1.6 mm，向后0.9 mm，腔深3.8 mm)分別給藥3-MA 5 μL(50 μg)、Sirtinol 5 μL(3.94 μg)。在模型制備過程中均用白熾燈加熱，維持肛溫37 ℃左右。術(shù)后大鼠麻醉蘇醒后，參照Longa的評分標(biāo)準(zhǔn)[7]，模型入選標(biāo)準(zhǔn)為1～3分，實驗組隨機(jī)補(bǔ)全，保證各組動物的數(shù)量不變。

1.4 尼氏染色法觀察尼氏體表達(dá)

大鼠缺血2 h,再灌注24 h后麻醉、心臟灌洗，冰上斷頭取腦、4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。切片行常規(guī)尼氏染色后用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察腦組織切片的染色情況，可見尼氏體存在于胞漿中呈深藍(lán)色顆粒。

1.5 Real-time QPCR檢測Sirt1和LC3 mRNA的表達(dá)

1.5.1 引物設(shè)計及合成：用Primer 5.0 軟件設(shè)計大鼠目的基因LC3、Sirt1和β-actin的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 大鼠目的基因LC3、Sirt1和β-actin的引物序列Table 1 Primer sequence of the rat LC3, Sirt1 and β-actin target gene

1.5.2 腦組織總RNA的提?。簩⒏鹘M大鼠于術(shù)后24 h斷頭處死，快速取出右側(cè)大腦組織的額頂葉皮質(zhì)，按RNAiso Plus提取試劑盒說明書提取組織的總RNA，檢測總RNA的濃度和純度，對A260/A280比值為1.8～2.2的樣品進(jìn)行下一步實驗。

1.5.3 Real time QPCR反應(yīng)：按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA作為模板，進(jìn)行real time QPCR反應(yīng)。引物序列：見表1。25 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 15 s，39個循環(huán)。以2-△△Ct(Ct代表循環(huán)閾值)表示基因的表達(dá)量△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.6 Western blot檢測Sirt1和LC3的蛋白表達(dá)

術(shù)后24 h，提取各組腦組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，上樣電泳，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBS漂洗膜3次， 封閉液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉溶于1×TBST緩沖液)室溫封閉1 h，將膜置于溶有一抗Sirt1或LC3或β-actin的封閉液中，室溫0.5 h，4 ℃過夜。次日用TBST漂洗膜3次，將膜放入已用封閉液稀釋的二抗中，室溫1h，TBST漂洗膜3次。ECL顯影，調(diào)節(jié)BIO-RAD凝膠成像儀的參數(shù)進(jìn)行曝光采圖，Quantity one軟件分析，測定并計算出LC3 Ⅱ與LC3 Ⅰ、Sirt1與β-actin條帶吸光度值比值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 TTC染色測定腦梗死的體積

用TTC染色法測定大鼠腦梗死體積。術(shù)后24 h，深度麻醉大鼠，立即斷頭取出除嗅球、小腦和低位腦干后的剩余腦組織，放于腦冠狀切片槽中，均勻切成厚度為2 mm薄片，迅速放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的TTC染液中，避光，37 ℃染色20 min后觀察腦片顏色，紅色為正常組織，蒼白色為梗死灶，用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛避光固定6 h，拍照，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量并計算出腦梗死的體積。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色對大鼠皮質(zhì)區(qū)的形態(tài)學(xué)觀察

S組大鼠皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的深藍(lán)色顆粒，即尼氏小體；I/R組神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，尼氏小體減少且淡染；經(jīng)不同濃度Res預(yù)處理后，R1和R2組減輕了大鼠皮質(zhì)區(qū)異常形態(tài)學(xué)改變，增加了尼氏小體的數(shù)量；而R2+3-MA組和R2+Sirtinol組大鼠皮質(zhì)區(qū)的病理改變加重，但比I/R組仍有改善(圖1)。

2.2 Real time QPCR檢測Res對Sirt1和LC3 mRNA表達(dá)水平的影響

與S組相比，I/R組腦組織Sirt1和LC3 的mRNA表達(dá)增加(P<0.01)，經(jīng)不同濃度Res預(yù)處理后，Sirt1和LC3 的mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，其中R2組差異更明顯(P<0.01)(圖2A)；Sirtinol處理組mRNA表達(dá)降低，3-MA處理組LC3 mRNA表達(dá)被抑制，但仍高于I/R組(P<0.01)(圖2B)。

2.3 Western blot檢測Res對Sirt1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表達(dá)水平的影響

與S組相比，I/R組腦組織Sirt1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，經(jīng)不同濃度Res預(yù)處理后，Sirt1和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，其中R2組差異更明顯(P<0.01)(圖3A)；Sirtinol處理組二者蛋白表達(dá)下降，3-MA處理組LC3 蛋白表達(dá)被抑制，但仍高于I/R組(P<0.01)(圖3B)

A.S group; B.I/R group; C.R1 group; D.R2 group; E.R2+3-MA; F.R2+Sirtinol

A.expression of Sirt1 and LC3 detected by real time QPCR；B.Sirtinol and 3-MA changed the expression of Sirt1 and LC3 detected by real time QPCR；*P<0.01 compared with S group;**P<0.01 compared with R2 group;#P<0.01 compared with I/R group;ΔP<0.01 compared with R1 group

圖2 Real time-QPCR分析中各組Sirt1和LC3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

2.4 腦梗死體積檢測

I/R組出現(xiàn)明顯的腦梗死灶，經(jīng)Res預(yù)處理后，R1和R2組梗死體積減小，R2組差異更明顯(P<0.01)；Sirtinol處理組和3-MA處理組腦梗死體積有所增大，但仍小于I/R組(P<0.01)(圖4)

3 討論

缺血性腦血管疾病是臨床上常見病和多發(fā)病，具有高致殘率、高囜死率等特點，嚴(yán)重威脅公眾健康。自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)[8]，LC3是自噬標(biāo)記性蛋白，具有LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ兩種形式，LC3 Ⅱ含量或LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值增高可反映自噬活性的增強(qiáng)[9]。研究表明[10- 11]，自噬在局灶性腦缺血/再灌注損傷中可被誘導(dǎo)激活且起保護(hù)作用。Res屬于非黃酮類多酚化合物，結(jié)構(gòu)簡單，具有抗感染、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和抗腫瘤等強(qiáng)大的生物學(xué)作用[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，與S組相比，I/R組大鼠出現(xiàn)明顯的腦梗死灶和病理學(xué)改變，以及LC3的表達(dá)增加，經(jīng)Res預(yù)處理后R1和R2組腦缺血/再灌注損傷引發(fā)的病理改變減輕，腦梗死體積減少及LC3的表達(dá)進(jìn)一步增加，這與本實驗前期研究結(jié)果一致[2]。且本實驗進(jìn)一步研究表明，與R2組相比，給予自噬抑制劑3-MA共處理3-MA+R2組，腦組織LC3表達(dá)降低，病理改變加重且腦梗死體積增加。證實Res可誘導(dǎo)腦I/R自噬激活發(fā)揮腦保護(hù)作用。

A.expression of Sirt1 and LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ detected by Western blot；B.Sirtinol and 3-MA changed the expression of Sirt1 and LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ detected by Western blot;*P<0.01 compared with S group;**P<0.01 compared with R2 group;#P<0.01 compared with I/R group;ΔP<0.01 compared with R1 group

圖3 各組神經(jīng)元中Sirt1和LC3蛋白的表達(dá)

red.normal brain tissue; white.infarction tissue;*P<0.01 compared with I/R group; #P<0.01 compared with R1 group；ΔP<0.01 compared with R2 group圖4 腦冠狀切片TTC染色

Sirt1作為一種NAD+依賴的去乙?；?，在哺乳動物腦神經(jīng)元中高表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)的損傷修復(fù)及神經(jīng)保護(hù)[12]。眾所周知，Res被認(rèn)為是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)Sirt1激動劑[5]。研究表明，在神經(jīng)變性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病)中，Res能通過上調(diào)Sirt1進(jìn)而誘導(dǎo)自噬發(fā)生起到神經(jīng)保護(hù)作用，對延緩神經(jīng)變性疾病進(jìn)展有重要意義[6]。

為了研究Res誘導(dǎo)激活腦I/R自噬的機(jī)制，進(jìn)一步檢測了Sirt1的表達(dá)。實驗結(jié)果顯示腦I/R模型中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，Res預(yù)處理R1和R2組可促進(jìn)Sirt1表達(dá)進(jìn)一步增加，Sirt 1抑制劑Sirtinol處理后，Res介導(dǎo)的Sirt1和LC3表達(dá)上調(diào)被抑制，且腦梗死體積增加，認(rèn)為Sirt1確實參與了Res誘導(dǎo)的自噬調(diào)控。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明Res在腦缺血/再灌注損傷中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生起腦保護(hù)作用，Res誘導(dǎo)激活自噬對腦缺血/再灌注起保護(hù)作用的機(jī)制可能與上調(diào)Sirt1的表達(dá)及活性有關(guān),為缺血性腦血管疾病的預(yù)防及臨床治療提供新的研究依據(jù)。

[1] Delmas D, Solary E, Latruffe N. Resveratrol, a phytochemical inducer of multiple cell death pathways: apoptosis, autophagy and mitotic catastrophe[J]. Curr Med Chem, 2011, 18: 1100- 1121.

[2] 郭倩, 余音, 潘乾廣, 等. 白藜蘆醇保護(hù)腦缺血/再灌注損傷與自噬關(guān)系的研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2013,29: 995- 998.

[3] 任俊偉，楊琴，范層層，等.白藜節(jié)醇保護(hù)腦缺血再灌注損傷及其機(jī)制[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010, 32: 2586- 2590.

[4] Lee IH，Cao L，Mostoslavsky R，etal.A role for the NAD-dependent deacetylase Sirtl in the regulation of autophagy[J]．Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105:3374- 3379.

[5] Stünkel W, Campbell R M. Sirtuin 1 (SIRT1) The Misunderstood HDAC[J]. J Biomol Screen, 2011, 16: 1153- 1169.

[6] Wu Y, Li X, Zhu JX,etal. Resveratrol-activated AMPK/SIRT1/autophagy in cellular models of Parkinson’s disease[J]. Neurosignals, 2011, 19:163- 174.

[7] Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S,etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20: 84- 91.

[8] 潘偉,劉世明. 自噬與心血管疾病[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2013,04:492- 495.

[9] 畢娟娟, 何 林, 余 音, 等. 自噬在熊果酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28: 601- 607.

[10] Su J, Zhang T, Wang K,etal. Autophagy activation contributes to the neuroprotection of remote Ischemic perconditioning against focal cerebral ischemia in rats[J]. Neurochem Res, 2014, 39:2068- 2077.

[11] Yan W, Zhang H, Bai X,etal. Autophagy activation is involved in neuroprotection induced by hyperbaric oxygen preconditioning against focal cerebral ischemia in rats[J]. Brain Res, 2011, 1402: 109- 121.

[12] Ramadori G, Lee CE, Bookout AL,etal. Brain SIRT1: anatomical distribution and regulation by energy availability[J]. J Neurosci, 2008, 28: 9989- 9996.

新聞點擊

時差反應(yīng)源自“體內(nèi)分子制動”

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年9月1日報道，英國牛津大學(xué)的研究人員認(rèn)為，他們發(fā)現(xiàn)“倒時差”的發(fā)生是由于阻止人體在飛行時依靠光線調(diào)節(jié)體內(nèi)生物鐘而導(dǎo)致的“分子制動”。

發(fā)表在《細(xì)胞》期刊上的這項實驗結(jié)果顯示，如果在大鼠體內(nèi)“打散”這些“分子制動”，實驗鼠就能很快適應(yīng)時差變化。研究人員希望，這個發(fā)現(xiàn)能有助于研發(fā)“倒時差”的新藥，并能幫助一些神精疾病的治療。

人體內(nèi)的生物鐘讓人們與外界晝夜的變更保持一致，并直接影響到人體夜間的休息,饑餓感的產(chǎn)生,情緒和血壓的變化。人們對于光線的反應(yīng)就像是一個“重啟按鍵”，讓人體和外界的時間保持一致。但當(dāng)人們從世界的一個地方飛往另一地方時，人體生物鐘需要時間來重新調(diào)整，這就導(dǎo)致人體出現(xiàn)多日體虛狀態(tài)，即“時差反應(yīng)”。

研究人員把研究的重心放在腦部一區(qū)域的“主時鐘”上。這個“主時鐘”讓機(jī)體其他地方隨時與其“同步”，該區(qū)域被稱為“視交叉上核”。他們針對那些由于光線變化而改變活動頻率的DNA進(jìn)行研究。他們發(fā)現(xiàn)，一群本來很活躍、并數(shù)量相當(dāng)?shù)幕?，由于一種叫做“SIK1”的蛋白質(zhì)的進(jìn)入，他們?nèi)吭俅芜M(jìn)入休眠狀態(tài)。如果對光線加以限制，這種蛋白質(zhì)就能像“踩剎車”一樣發(fā)揮作用。實驗發(fā)現(xiàn)，如果降低這種蛋白質(zhì)的功能，實驗鼠就能迅速適應(yīng)6 h的時差。

Resveratrol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury by promoting autophagy through Sirtuins1 pathway in rats

SHI Yao, GUO Qian, ZHOU Ye-han, WAN Dan, YE Xiu-feng*

(Dept. of Pathology, Institute of Neurosciences,Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Objective To observe the potential roles of autophagy induced by Resveratrol(Res) in rats model of focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R)injury. Methods Rats were randomly divided into sham-operated group(S group), cerebral ischemia-reperfusion group (I/R group), low and high dose of Res pretreatment (15 and 40 mg/kg) group (R1 and R2 group); and R2 group were randomly sub-divided into R2+3-MA group and R2+Sirtinol group. The focal cerebral ischemia-reperfusiong (I/R) rat models were established by the middle cerebral artery occlusion (MCAO) using intraluminal suture method. Nissl’s staining was used to observe the pathological changes of brain tissue; 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) straining was used to observe infarct volume; real-time QPCR and Western blot assessments were performed to analyse the mRNA and protein expression of microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) and mammalian sir2-related protein 1 (Sirt1), respectively. ResultsCompared with S group,I/R group showed obvious focal cerebral infarct, pathological damage change and autophagy related protein LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ, Sirt1 expression increased. Res pretreatment can significantly alleviate the pathological injury of rat cortical area, reduce the infarction volume (P<0.01) and increase the expression of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ and Sirt1 (P<0.01); while the Sirt1 inhibitor and 3-MA can weaken the effect of Res. Conclusions Resveratrol enhances autophagy through activation of SIRT1 pathway and autophagy induction plays an important role in the neuroprotection of resveratrol in rats model of focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R)injury.

cerebral ischemia/reperfusion injury; resveratrol; autophagy; sirtuins1

2014- 10- 13

2014- 12- 29

重慶市科技攻關(guān)計劃項目(2008AB5118)

1001-6325(2015)04-0496-06

R741；R285.5；R-332

A

*通信作者(corresponding author)：yxf1960@126.com