萬(wàn)蝶　吳長(zhǎng)德

摘 要：金黃色葡萄球菌在自然界中的分布極其廣泛，存在于空氣、水和土壤中，寄居在人和動(dòng)物的皮膚黏膜、鼻腔、咽喉以及胃腸道等處，是臨床上常見(jiàn)的致病菌之一。由于其可以產(chǎn)生溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶等，在臨床可引起各種家畜的呼吸道感染、子宮內(nèi)膜炎、外傷化膿、乳房炎，若治療不及時(shí)會(huì)引起敗血癥而導(dǎo)致死亡。近些年，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，目前臨床分離的金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，而且出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，這給臨床治療帶來(lái)極大的困難，金黃色葡萄球菌的耐藥問(wèn)題已經(jīng)引起人們的極大關(guān)注。

東北虎作為世界一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，近年來(lái)時(shí)有病原微生物感染死亡的報(bào)道。本研究旨在研究虎源金黃色葡萄球菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性，并通過(guò)對(duì)相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)，分析其耐藥機(jī)制，為今后指導(dǎo)臨床合理使用抗生素防控野生動(dòng)物金黃色葡萄球菌感染提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：虎；金黃色葡萄球菌；耐藥性；耐藥機(jī)制

本實(shí)驗(yàn)采集病死東北虎的化膿性腎臟，通過(guò)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、純化，染色、鏡檢以及PCR方法進(jìn)行鑒定；以金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc）為靶基因，選擇特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用來(lái)鑒定金黃色葡萄球菌；采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，分析其耐藥性；液體培養(yǎng)分離菌株，提取細(xì)菌DNA，根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，針對(duì)相應(yīng)的耐藥基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR方法對(duì)相關(guān)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，分析其耐藥機(jī)制。

1 虎源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1 金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng) 將沈陽(yáng)森林野生動(dòng)物園的病死東北虎腎臟及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。切取平整病料，在瓊脂平板上劃板，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，將可疑菌落涂片染色鏡檢，并繼續(xù)劃板，進(jìn)行純化培養(yǎng)。若確定為金黃色葡萄球菌，則需挑取菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，震蕩混勻后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)8小時(shí)后，置于30%甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 金黃色葡萄球菌的鑒定 形態(tài)鑒定和革蘭氏染色鏡檢；并提取細(xì)菌基因組DNA，設(shè)計(jì)、合成金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc引物，利用PCR鑒定金黃色葡萄球菌，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物大小。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30S，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min結(jié)束反應(yīng)，產(chǎn)物于4℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果 在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成灰白色、濕潤(rùn)、隆起、表面光滑的菌落（圖1）。

1.2.2 染色結(jié)果 對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察，可見(jiàn)葡萄串狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌，無(wú)鞭毛、無(wú)莢膜、無(wú)芽孢，可初步判定為葡萄球菌（圖2）。

1.2.3 耐熱核酸酶基因檢測(cè)結(jié)果 提取菌株基因組DNA為模板，對(duì)nuc基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在250bp附近出現(xiàn)單一清晰的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期目的片段相符，為279bp（圖3）。

1.2.4 nuc基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果 將PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與NCBI上收錄的基因進(jìn)行比對(duì)，同源性為99%，確定擴(kuò)增產(chǎn)物為nuc基因。

2 金黃色葡萄球菌體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2.2 抗菌藥物

藥敏紙片；β-內(nèi)酰胺類(lèi)：阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟；氨基糖苷類(lèi)：阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素；大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)：紅霉素、克林霉素、阿奇霉素；喹諾酮類(lèi)：恩諾沙星、環(huán)丙氟哌酸；四環(huán)素類(lèi)：四環(huán)素、強(qiáng)力霉素；氯霉素類(lèi)：氯霉素、氟苯尼考；糖肽類(lèi)：萬(wàn)古霉素；共計(jì)7大類(lèi)16種。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 將菌株活化 -80℃?zhèn)溆玫慕瘘S色葡萄球菌菌株在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)48小時(shí)。

2.3.2 增殖培養(yǎng) 從增殖菌液中取15微升放入20毫升營(yíng)養(yǎng)肉湯后，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3.3 對(duì)菌濃度的測(cè)定 以營(yíng)養(yǎng)肉湯為空白對(duì)照，不同生長(zhǎng)階段的菌液為樣品，用分光光度計(jì)測(cè)定其OD值，OD600的數(shù)值范圍在0.6左右時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（約培養(yǎng)8小時(shí)），此時(shí)適合做藥敏實(shí)驗(yàn)。

2.3.4 藥敏實(shí)驗(yàn) 將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，用鑷子夾取藥敏片貼在培養(yǎng)基平板上。每種藥物貼3次藥敏片，將培養(yǎng)基平板放入37℃恒溫箱，16～18小時(shí)后觀察結(jié)果。參照CLSI（2012）公布的三種形式：敏感（Susceptible）、中介（Intermediate）、耐藥（Resistant），對(duì)抑菌圈大小的標(biāo)準(zhǔn)作出判定。個(gè)別使用藥物CLSI（2012）沒(méi)有列出，按杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的抑菌環(huán)，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑的大小，記錄結(jié)果（圖4）。

從表3可以看出，金黃色葡萄球菌分離菌株對(duì)阿米卡星、紅霉素、克林霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、環(huán)丙氟哌酸、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考和慶大霉素表現(xiàn)出敏感的狀態(tài)；對(duì)氯霉素和萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出中介的狀態(tài)；對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥的阿莫西林、氨芐西林和頭孢噻肟表現(xiàn)出耐藥的狀態(tài)。

3 虎源金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥耐基因的檢測(cè)

3.1 實(shí)驗(yàn)方法

3.1.1 引物設(shè)計(jì) 提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，并設(shè)計(jì)合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥基因PCR擴(kuò)增引物（表4）。

3.1.2 β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物4種耐藥基因的檢測(cè) 以金黃色葡萄球菌基因組為模板，對(duì)mecA、femA、TEM、SHV等4種基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)體系為30微升（表5）。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3分鐘，95℃變性30秒，退火30秒，擴(kuò)增mecA退火溫度為57℃，擴(kuò)增femA的退火溫度為55℃，擴(kuò)增TEM的退火溫度為55℃，擴(kuò)增SHV的退火溫度為60℃，72℃延伸1分鐘，從第二步起共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)，產(chǎn)物于4℃保存。

3.1.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5微升PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中，120V電泳30分鐘，選用DL-2000 DNA Marker分子量標(biāo)準(zhǔn)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

3.1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 將膠回收的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析，并與GenBank上收錄的序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 TEM基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外光觀察，顯示擴(kuò)增獲得約309 bp的特異性條帶，與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符（圖5）。

SHV基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外光觀察，顯示擴(kuò)增得到約176bp的特異性條帶，與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符（圖6）。

3.2.2 測(cè)序結(jié)果 將SHV基因測(cè)序結(jié)果與NCBI上收錄的SHV基因序列（blaSHV-154，gb|JX121121.1|）進(jìn)行比對(duì)，同源性為97%，可以確定擴(kuò)增基因?yàn)镾HV基因。

將TEM基因測(cè)序結(jié)果與NCBI上收錄的TEM基因序列（TEM，gb|KF963580.1|）進(jìn)行比對(duì)，同源性為99%?？梢源_定擴(kuò)增的基因?yàn)門(mén)EM基因。

4 結(jié)論

從死亡東北虎的腎臟成功分離出金黃色葡萄球菌；該分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物：頭孢噻肟、阿莫西林和氨芐西林等耐藥；對(duì)四環(huán)素、克林霉素、強(qiáng)力霉素、阿米卡星、紅霉素、恩諾沙星、慶大霉素、阿奇霉素、鏈霉素、環(huán)丙氟哌酸等高度敏感，對(duì)氯霉素和萬(wàn)古霉素中度敏感；從分離菌株中PCR擴(kuò)增出TEM、SHV耐藥基因，說(shuō)明產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致虎源金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、阿莫西林等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制。