耿士忠，安樹敏，曾 玲，郭榮顯，薛 穎，蔣遠遠，潘志明，焦新安

（揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州225009）

雞白痢（Pullorum disease，PD）是由雞白痢沙門菌（Salmonella Pullorum）引起的一種急性、全身性疾病，也是一種常見傳染病，能引起雛雞高發(fā)病率和高死亡率，是嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的疾病之一，并造成嚴重經(jīng)濟損失。

目前，除了抗生素，沙門菌活疫苗被普遍認為是預(yù)防和治療沙門菌病的有效手段。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)spiC::km 突變株顯著地降低了其致病性，除了能夠激發(fā)體液免疫外，還能夠引起細胞免疫和黏膜免疫，且細菌在體內(nèi)只能短暫的生存，很快就被機體清除。此突變株具有沙門菌減毒活疫苗的特征和要求。本試驗旨在從病理學角度觀察spiC::km 突變株的致病性。

1 材料與方法

1.1 細菌對雛雞的感染試驗

1.1.1 細菌的準備 取新鮮培養(yǎng)的spiC::km 突變菌株及野生菌S06004 的單個菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 min/r 搖振培養(yǎng)10 h，6 000 r/min 離心10 min，收集菌體，用PBS 洗滌細菌3 次，接種前用1%NaHCO3調(diào)節(jié)細菌至所需濃度，備用。

1.1.2 接種 將準備好的細菌口服接種1 日齡海藍白雛雞，并設(shè)立不同的濃度細菌接種組，分別109CFU/mL，108CFU/mL，107CFU/mL，每羽100 μL，5 只/組。設(shè)立野生菌S06004 感染陽性對照組與空白對照組。

1.2 病變觀察

1.2.1 臨床癥狀觀察 接種細菌后，觀察接種雞的生長狀況及外在表現(xiàn)，連續(xù)觀察8 d，主要觀察內(nèi)容包括：a：精神不佳；b：嗜睡、羽毛蓬亂；c：腹瀉（白?。?；d：死亡[1-2]。

1.2.2 病理組織學變化 觀察接種后6 d 試驗雞的大體病變，采集試驗雞的十二指腸道、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、盲腸等臟器，以10%中性福爾馬林溶液固定，按常規(guī)制備上述臟器的石蠟組織切片，H.E.染色，觀察相應(yīng)的病理變化[3]。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察 觀察結(jié)果表明，spiC::km 突變菌株相比野生菌，幾乎不能引起雞明顯的外在病理表現(xiàn)。在觀察期內(nèi)，野生菌S06004 都能導(dǎo)致典型的白痢腹瀉癥狀，但隨著劑量的增加，導(dǎo)致的死亡數(shù)也在相應(yīng)地增加，即使沒有死亡的雞也表現(xiàn)出嚴重白痢腹瀉。從體重上看，spiC::km 突變菌株對雛雞生長沒有影響，和空白對照組相比，略有增加；而野生菌S06004 作為陽性對照組，該菌則嚴重影響了雛雞的生長，體重顯著下降。

2.2 組織切片觀察結(jié)果 野生菌S06004 組：肝臟淤血，脂肪變性，少量肝細胞凝固性壞死；肺臟也有淤血；十二指腸黏膜絨毛壞死脫落，壞死區(qū)的整個黏膜層漿膜充血；脾臟淋巴細胞數(shù)量減少；盲腸黏膜層壞死，黏膜下層充血。

spiC::km 突變菌株組：肝臟輕微脂肪變性；其它組織無明顯病變，基本正常。

從結(jié)果中可明顯看出，spiC::km 突變菌株引起雛雞病理變化與正常對照相差不大，與野生菌相比癥狀顯著減輕。進一步證明spiC::km 突變菌株相對野生菌毒力較弱（見中插彩版圖1）。

空白對照組：無病理變化。

3 討論

雞白痢沙門菌在我國家禽養(yǎng)殖業(yè)中造成嚴重的危害[4]，主要是由于該沙門菌除了具有免疫逃逸及水平傳播能力外，還具有垂直傳播的能力，導(dǎo)致防疫困難?，F(xiàn)行有效的防控對策是生物安全控制和凈化措施，基本原則是淘汰感染雞（群）。根據(jù)我國的國情，該措施實際實施難度大且代價昂貴。抗生素治療雖有一定的效果，但不能完全阻止細菌感染，且長期使用抗生素已產(chǎn)生了多重耐藥性和藥物蓄積殘留等諸多公共衛(wèi)生問題[5]。為此，在我國及其他發(fā)展中國家迫切需要探索包括免疫預(yù)防在內(nèi)的新的防控措施。

由于傳統(tǒng)的滅活疫苗免疫效果不佳，免疫途徑不方便而逐漸被淘汰。許多國家逐漸轉(zhuǎn)向研究活疫苗來預(yù)防控制沙門菌病，并取得了很好的效果[6]，隨著現(xiàn)代生物學和DNA 重組技術(shù)的發(fā)展，以及對沙門菌毒力遺傳學的深入研究和了解，為在該病原體基因組中進行基因敲除制備等位基因突變體具備了可能性，這些突變體為研制沙門菌減毒活疫苗及基因功能研究提供了遺傳學基礎(chǔ)[7]。

我們根據(jù)雞白痢沙門菌特有的生物學特性，運用轉(zhuǎn)座突變的方法，發(fā)掘雞白痢沙門菌具有減毒功能的基因決定簇。通過致病性的比較，雞白痢沙門菌spiC::km 突變株具有顯著的減毒效應(yīng)，說明該基因滅活的雞白痢沙門菌具有發(fā)展為減毒活疫苗的潛力。

spiC 基因是沙門菌2 型III 型分泌系統(tǒng)的蛋白之一，其功能已經(jīng)被廣泛研究[8]，但至今末有統(tǒng)一的結(jié)論，有待進一步探索。

[1] Wigley P，Hulme S D，Bumstead N，et al.In vivo and in vitro studies of genetic resistance to systemic salmonellosis in the chicken encoded by the SAL1 locus[J].Microbes Infect，2002，4：1111-1120.

[2] Shivaprasad H L.Fowl typhoid and pullorum disease[J].Rev Sci Tech，2000，19：405-424.

[3] 李和，周莉.組織化學與免疫組織化學[M].北京，人民衛(wèi)生出版社，2008：9.

[4] 盧艷，劉蕾，劉文博，等.1 株可形成生物膜雞白痢沙門菌的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（9）：19-21.

[5] 焦新安，劉秀梵.禽沙門菌病流行現(xiàn)狀與防制對策[J].中國禽業(yè)導(dǎo)刊，1998，15（1）：23-24.

[6] 朱其太.雞沙門菌病的疫苗防治[J].中國家禽，2000，17（3）10.

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[8] Kuhle V，Hensel M.Cellular microbiology of intracellular Salmonella enterica：Functions of the type IIIsecrection system encoded by Salmonella pathogenicity island 2[J].Cell Mol Life Sci，2004，61：2812-2826.