方虹霞　張　琪　張慧麗　杜　勇　洪　治（中國計量學(xué)院太赫茲技術(shù)與應(yīng)用研究所，杭州310018）

腺嘌呤與富馬酸共晶體的太赫茲光譜分析

方虹霞張琪張慧麗杜勇*洪治
（中國計量學(xué)院太赫茲技術(shù)與應(yīng)用研究所，杭州310018）

利用太赫茲時域光譜（THz-TDS）技術(shù)在室溫下對腺嘌呤、富馬酸及兩者的共晶體進行測量，實驗結(jié)果顯示腺嘌呤與富馬酸共晶體在0.92、1.24、1.52 THz處有明顯的吸收峰，與腺嘌呤和富馬酸不同，表明共晶體物相結(jié)構(gòu)不同于原料.根據(jù)腺嘌呤分子氫鍵供體與受體的結(jié)構(gòu)特點，使用密度泛函理論（DFT）對腺嘌呤與富馬酸三種可能的共晶體結(jié)構(gòu)進行模擬.結(jié)果顯示其中一種可能的共晶體結(jié)構(gòu)在0.89、1.16、1.41 THz處存在特征吸收峰，與實驗結(jié)果較好吻合.由此判斷腺嘌呤與富馬酸共晶體氫鍵形成位置為腺嘌呤的氨基與富馬酸其中一個羧酸的碳氧雙鍵形成氫鍵，而此羧酸的羥基與腺嘌呤六元環(huán)上的鄰位氮原子形成第二處氫鍵.本文還結(jié)合理論模擬的結(jié)果對腺嘌呤與富馬酸共晶體的特征吸收峰對應(yīng)的相關(guān)振動模式進行了歸屬.

腺嘌呤；富馬酸；共晶體；氫鍵；太赫茲時域光譜；密度泛函理論

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1　引言

DNA與許多化合物或天然小分子相互作用形成氫鍵，一直是化學(xué)治療的熱門研究方向，1小分子通過插入溝槽或靜電模式的方式與DNA結(jié)合已促進了多種新型抗癌2及抗菌3藥物的發(fā)展.腺嘌呤作為DNA的一種堿基，它與其他小分子的相互作用也已被研究報道.Thompson等4使用X射線衍射技術(shù)檢測了腺嘌呤與富馬酸、馬來酸及琥珀酸的共晶體；Byres等5使用X射線衍射技術(shù)發(fā)現(xiàn)腺嘌呤和質(zhì)子化腺嘌呤能與2，6-二羥苯甲酸、3，5-二羥苯甲酸、已二酸等形成共晶體；Perumaila等6也檢測了腺嘌呤與苯甲酸共晶體；此外，腺嘌呤還能與水楊酸、7，8草酸、9等形成共晶體.觀察以上共晶體可發(fā)現(xiàn)參與共晶形成的腺嘌呤包括9H腺嘌呤和7H腺嘌呤（如圖1所示，“↑”表示氫鍵供體位置，“↓”表示氫鍵受體位置）；10此外，水、甲醇等作為溶劑會參與氫鍵網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成，從而形成了含水共晶體或含甲醇共晶體，如腺嘌呤與2，6-二羥苯甲酸含水共晶體、5腺嘌呤與已二酸含甲醇共晶體8及腺嘌呤與草酸含水共晶體9等.溶劑參與氫鍵網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成會打斷腺嘌呤與共晶形成物（CCF）之間的直接氫鍵形成，不利于進一步研究腺嘌呤與CCF之間的相互作用.

有關(guān)研究表明，9H腺嘌呤在氣相中或水溶液中是腺嘌呤同分異構(gòu)體中最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，10-12而9H腺嘌呤與7H腺嘌呤之間的能量差在氣相中為29.3-33.5 kJ·mol-1，而且在極性溶液中兩者之間的能量差值會減少.13，14針對上述問題，本實驗采用極性低于水與甲醇的無水乙醇作為溶劑制備溶液共晶體，降低溶劑引起腺嘌呤異構(gòu)體之間轉(zhuǎn)變的可能性，同時制備研磨共晶體，與溶液共晶體對比，觀察溶劑是否參與氫鍵形成.選用富馬酸作為CCF與腺嘌呤形成共晶體，是基于富馬酸包含雙羧基，有利于與腺嘌呤的氫鍵受體、供體形成雙位氫鍵，更易于氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成.

太赫茲波段位于微波和紅外輻射之間，其頻段為0.1-10 THz（頻率為1 THz的光子能量為4.1 meV），15與大部分有機分子及分子團的振動和轉(zhuǎn)動能級之間躍遷的能量大致相當(dāng).相對于X射線衍射技術(shù)能量高，可能引起晶型轉(zhuǎn)變的缺點，太赫茲時域光譜（THz-TDS）技術(shù)具有無損、快速檢測的優(yōu)點.近年來，太赫茲時域光譜技術(shù)已被用于共晶檢測中.16-18

本文制備了以乙醇為溶劑的腺嘌呤與富馬酸溶液共晶體和研磨共晶體，采用太赫茲時域光譜技術(shù)對腺嘌呤、富馬酸與兩者的溶液共晶體及研磨共晶體進行表征.通過譜圖對比，確認(rèn)了共晶體的形成，并分析乙醇是否參與了共晶體的氫鍵形成.運用密度泛函理論對腺嘌呤與富馬酸共晶體形成的三種可能結(jié)構(gòu)進行模擬，結(jié)合理論模擬結(jié)果確認(rèn)共晶體結(jié)構(gòu)，并對共晶體的特征峰進行振動模式歸屬.

圖1　9H和7H腺嘌呤受體與供體的可能位置Fig1　Possible positions of donor and accepter for 9H and 7H adenine

2　實驗

2.1樣品制備

腺嘌呤、富馬酸均購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，純度均大于99%，使用前未進行進一步的純化.

2.1.1溶液共晶體的制備

使用精度為0.0001 g的電子天平（BSA-124S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）分別稱取摩爾比為1：1的腺嘌呤及富馬酸，將其溶于溫?zé)岬臒o水乙醇中，冷卻至室溫，自然蒸發(fā)即可得到溶液共晶體樣品.

2.1.2研磨共晶體的制備

分別將兩種藥品在研缽中研磨成細小顆粒，然后使用電子天平稱取摩爾比為1：1的腺嘌呤與富馬酸，并利用漩渦混合器（QL-901，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）震蕩15 min，以確?；旌铣浞?，然后將樣品放入行星式球磨機（QM-3SP04，南京大學(xué)儀器廠）內(nèi)，在頻率25 Hz下研磨120 min獲得研磨共晶體.

2.2樣品表征

THz-TDS采用（美國Zomega公司）Z2測量系統(tǒng).激發(fā)光源為Spectra Physics公司的鈦藍寶石飛秒鎖模脈沖激光器，激光重復(fù)頻率80 MHz、脈寬100 fs、中心波長800 nm.使用FW-4型壓片機（天津天光光學(xué)儀器有限公司）將樣品在4 MPa的壓力下壓制成直徑為13 mm、厚度為1.5-1.7 mm無裂縫且兩端面平行的樣片.樣品測試在室溫下進行，且使用氮氣進行除濕，使樣品腔相對濕度保持在0%.

3　理論計算

本文采用Gaussian 03軟件19分別對腺嘌呤、富馬酸及兩者共晶體進行分子模擬，選取密度泛函理論B3LYP方法，20，21結(jié)合基組6-31G（d，p）進行理論計算.模擬計算中，首先進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，再進行頻率計算.所有樣品的計算結(jié)果沒有出現(xiàn)虛頻，說明所有優(yōu)化都找到了分子最小能量結(jié)構(gòu).考慮到模擬中沒有完全考慮電子相關(guān)作用和其對非簡諧性效應(yīng)的忽略，以及基組選擇等因素，采用相應(yīng)矯正因子0.96.22實驗結(jié)果顯示溶液與研磨共晶體的物相結(jié)構(gòu)相同，由此判斷乙醇并未參與氫鍵形成.根據(jù)上文分析及Thompson等4實驗結(jié)果可確定參與共晶體氫鍵形成的是9H腺嘌呤.同時依據(jù)氫鍵合成元（羧酸-羧酸、羧酸-吡啶、羧酸-酰胺、醇-吡啶、醇-胺）23和9H腺嘌呤的氫鍵供體和受體的位置，理論認(rèn)為9H腺嘌呤與富馬酸共晶體的單分子結(jié)構(gòu)如圖2所示，圖2A中9H腺嘌呤六元環(huán)的N1與富馬酸羧基的―O1H形成第一處氫鍵，而這個羧基的C1=O2與N10―H形成第二處氫鍵，由此形成腺嘌呤與富馬酸共晶體的雙位氫鍵；圖2B中富馬酸的C1=O2與N10―H形成第一處氫鍵，且此羧基的O1H與腺嘌呤五元環(huán)上的N7形成第二處氫鍵；圖2C中C1=O2與腺嘌呤五元環(huán)上的N9―H形成第一處氫鍵，而O1H與腺嘌呤六元環(huán)上的N3則形成第二處氫鍵.

圖2　9H腺嘌呤與富馬酸三種共晶體理論晶型Fig 2　Three theoretical structures of cocrystal between 9H adenie and fumaric acid

4　結(jié)果與分析

腺嘌呤與富馬酸共晶體的太赫茲譜如圖3所示.圖3A為腺嘌呤與富馬酸溶液共晶體和其研磨共晶體的光譜結(jié)果比較，從圖中可看出腺嘌呤與富馬酸溶液共晶體和其研磨共晶體在太赫茲譜圖中特征峰出現(xiàn)的位置相同，表明兩者物相結(jié)構(gòu)一致，且說明了乙醇并未參與氫鍵的形成.圖3B為腺嘌呤與富馬酸共晶體及其原料的太赫茲吸收譜對比.由圖3B可知，相對于原料，共晶體的太赫茲譜圖在0.92、1.24、1.52 THz處都有明顯的吸收峰，與原料不同.

理論模擬與實驗譜圖對比如圖4所示，共晶體理論晶型A相對于另外兩種共晶體理論晶型（B和C）的光譜模擬結(jié)果與實驗所得共晶體太赫茲吸收譜圖更相符.共晶體理論晶型A的特征吸收峰位于0.89、1.16、1.41 THz處，對應(yīng)共晶的實驗吸收峰位于0.92、1.24、1.52 THz處，因此認(rèn)為腺嘌呤與富馬酸共晶體結(jié)構(gòu)為理論模擬中的晶型A構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)如圖5所示.這一結(jié)果與Thompson等4使用X射線衍射檢測所得結(jié)果一致.氫鍵的形成對于分子內(nèi)鍵長、鍵角的影響如表1、2所示（實驗數(shù)據(jù)見文獻24，25），氫鍵N3―H4…O20和O21―H19…N6的形成使得N3―H4的鍵長由0.1007 nm伸長至0.1023 nm；C9N6的鍵長由0.1345 nm伸長至0.1358 nm；O21―H19的鍵長由0.0972 nm伸長至0.1028 nm；原子之間的鍵長變長使得原有振動模式的頻率降低，即紅移現(xiàn)象，這也是共晶體的太赫茲譜圖（圖3）中0.92、1.24 THz處兩個新峰產(chǎn)生的原因.而C17―O21的鍵長則由0.1355 nm縮短至0.1319 nm.此外，參與氫鍵形成的化學(xué)鍵角都有所增大，從而也使得共晶體的振動光譜圖區(qū)別于原料樣品.模擬和實驗結(jié)果之間鍵長的差別和特征吸收峰存在少許偏移，都是因為實驗是在常溫下進行的，而理論模擬是在絕對零度下進行的，沒有考慮熱效應(yīng)；且實驗結(jié)果是整個晶格的振動，而計算模擬僅僅針對單個共晶體分子.

圖3　腺嘌呤、富馬酸及兩者共晶體的太赫茲譜圖Fig 3　THz spectra of adenine，fumaric acid，and cocrystals （A）solvent and grinding cocrystal；（B）adenine，fumaric acid，and cocrystal

圖4　腺嘌呤與富馬酸共晶體理論結(jié)構(gòu)A型，B型，C型太赫茲吸收光譜與實驗結(jié)果對比Fig4　Comparison of experimental and formA，form B，form C theoretical THz absorption spectra of cocrystal between adenie and fumaric acid （a）experimental result；（b）theoretical formA；（c）theoretical form B；（d）theoretical form C

表1　腺嘌呤與富馬酸中氫鍵的鍵長變化Table 1　Change of hydrogen bond length between adenine and fumaric acid

圖5　腺嘌呤與富馬酸理論共晶體晶型A模擬優(yōu)化結(jié)構(gòu)Fig5　Optimized structure of theoretical cocrystal formAbetween adenie and fumarinc acid

分子在太赫茲低頻波段的振動主要源于多個原子參與的變形振動、扭動振動和彎曲振動26或氫鍵作用引起的相對振動，且不同峰位的振動模式不同.通過GaussianView的動態(tài)觀察，可對腺嘌呤與富馬酸共晶體的振動模式進行大致的歸屬，結(jié)果見表3.腺嘌呤與富馬酸共晶體在0.92 THz處的吸收峰是由富馬酸的碳鏈C23―C22=C16―C17集體面外搖擺振動和腺嘌呤的氨基H4―N3―H5面外搖擺振動共同引起的，如圖6（a）所示；在1.24 THz處的吸收峰是由O25=C23―O26面內(nèi)彎曲振帶動共晶體的氫鍵O21―H19…N6振動，并以O(shè)21―H19…N6為連接軸引起腺嘌呤分子面內(nèi)彎曲振動所共同作用引起的，如圖6（b）所示；在1.52 THz處的吸收峰則是由富馬酸的兩個羧基O25=C23―O26，O20=17C―O21扭曲振動，并以O(shè)21―H19…N6為軸使得腺嘌呤分子產(chǎn)生面外搖擺振動所引起的，而腺嘌呤的H4―N3―H5面外搖擺振動加深了這一作用，如圖6（c）所示.此外，根據(jù)計算結(jié)果腺嘌呤與富馬酸共晶體在3.05 THz處有一個以氫鍵O21―H19…N6為軸的兩個分子共同作用的剪式振動所產(chǎn)生的吸收峰，但在實驗中由于儀器光譜有效頻段范圍的限制未能在實驗譜圖中體現(xiàn).

表2　腺嘌呤與富馬酸中氫鍵的鍵角變化Table 2　Change of bond angle length between adenine and fumaric acid

表3　腺嘌呤與富馬酸共晶體的振動模式Table3　Vibrational modes of cocrystal between adenine and fumaric acid

圖6　腺嘌呤與富馬酸共晶體位于0.92，1.24，1.52 THz處的振動模式Fig 6　Vibrational modes of cocrystal between adenie and fumaric acid at 0.92，1.24，1.52 THz

根據(jù)實驗及計算結(jié)果可知，氫鍵的形成使得腺嘌呤分子與富馬酸分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)有一些變化，且在各自的振動模式下受到對方的影響，這也使得腺嘌呤與富馬酸共晶體在太赫茲波段呈現(xiàn)出和原料完全不同的特征吸收譜.

5　結(jié)論

使用THz-TDS技術(shù)在室溫下對腺嘌呤、富馬酸及兩者的溶液和研磨共晶體進行表征和分析，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤與富馬酸的溶液共晶體與研磨共晶體在0.92、1.24及1.52 THz處都有明顯且區(qū)別于原料樣品的吸收峰；由于兩種方法得到的物相結(jié)構(gòu)一致，從而說明乙醇作為弱極性溶劑并未參與氫鍵的形成.采用密度泛函理論對腺嘌呤與富馬酸由氫鍵作用而形成共晶體的三種可能結(jié)構(gòu)進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化與光譜模擬，并將計算結(jié)果與實驗結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)其中共晶體理論晶型A的模擬結(jié)果與實驗太赫茲譜圖結(jié)果吻合度很高，據(jù)此推斷共晶體的氫鍵形成位置為腺嘌呤的氨基與富馬酸其中一個羧酸的碳氧雙鍵形成一處氫鍵，而此羧酸的羥基與腺嘌呤六元環(huán)上的鄰位氮原子形成第二處氫鍵.該結(jié)論與X射線衍射結(jié)果一致.為太赫茲光譜技術(shù)檢測和分析共晶體結(jié)構(gòu)及氫鍵作用提供了實驗與理論參考.

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1.3 調(diào)查工具 調(diào)查問卷為自制問卷，內(nèi)容包括:①護士一般資料:性別、出生年月、學(xué)歷、職稱和入職時間;②科室職業(yè)防護用具的配備;③護士在靜脈輸液過程中職業(yè)防護認(rèn)知及現(xiàn)狀調(diào)查。該部分分為3個維度，共有37個條目。問卷經(jīng)專家鑒定，內(nèi)容效度為0.89。采用預(yù)實驗20例樣本所有數(shù)據(jù)，測得Cronbach's α 系數(shù)為0.865。

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Terahertz Spectroscopic Analysis of Adenine and Fumaric Acid Cocrystals

FANG Hong-XiaZHANG QiZHANG Hui-LiDU Yong*HONG Zhi
（Centre for Terahertz Research，China Jiliang University，Hangzhou 310018）

The absorption spectra of adenine，fumaric acid，and their cocrystal were measured using terahertz time-domain spectroscopy（THz-TDS）at room temperature.Experimental results show that they all have distinct fingerprint spectra in the terahertz region.The absorption peaks observed in the terahertz spectra of the cocrystal were at 0.92，1.24，and 1.52 THz.These are very different from the corresponding reagents.Based on the characteristic hydrogen donor and/or acceptor behavior of adenine，density functional theory（DFT）was used to simulate three possible theoretical cocrystal structures with a focus on hydrogen bond formation between adenine and fumaric acid.The theoretical result shows that one of three possible simulated cocrystal structures had absorption peaks at 0.89，1.16，and 1.41 THz，which is in agreement with the terahertz experimental result.Therefore，the structure of the cocrystal was confirmed wherein the first hydrogen bond is formed between the amino group of adenine and the hydroxyl group of fumaric acid.The second hydrogen bond is formed between the nitrogen atom of the nitrogen ring in adenine and the carbonyl group of fumaric acid. The characteristic absorption bands of the cocrystal between adenine and fumaric acid are also assigned based on the simulation results from the DFT calculation.

Adenine；Fumaric acid；Cocrystal；Hydrogen bond；Terahertz time-domain spectroscopy；Density functional theory

November 5，2014；Revised：December 22，2014；Published on Web：December 23，2014.

?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

O641；O657.3

10.3866/PKU.WHXB201412232

The project was supported by theNationalNatural Science Foundation of China（21205110）.

國家自然科學(xué)基金（21205110）資助項目