薛麗麗 閆冰 李一

1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科；2.耳鼻喉頭頸外科，廈門 361003；3.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科（四川大學(xué)），成都 610041

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是交叉學(xué)科的興起和發(fā)展，光譜學(xué)被越來越多地應(yīng)用在醫(yī)學(xué)研究中。光譜學(xué)主要是通過分析樣本的反射光和吸收光之間的改變而研究被測樣本的一門學(xué)科。在醫(yī)學(xué)研究中，光譜學(xué)主要涉及紅外光譜、熒光光譜和拉曼光譜[1]。相對于前兩者而言，拉曼光譜具有光譜信息豐富，對樣本無需特殊處理和受組織內(nèi)水分影響小等優(yōu)點，近年來成為臨床原位診斷技術(shù)的研究熱點[2]。本文通過復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，對拉曼光譜在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用作一綜述。

1 拉曼光譜的原理

拉曼散射是由印度科學(xué)家拉曼于1928年發(fā)現(xiàn)[3]。從量子力學(xué)的角度解釋，拉曼散射是指一部分光射向物體后發(fā)生的非彈性散射，其光子的能量被物體分子中處于基態(tài)的電子獲取使得電子躍遷至一個虛態(tài)，處于虛態(tài)的電子不穩(wěn)定，有向外釋放能量回到穩(wěn)態(tài)的趨勢，向外釋放的能量以光子的形態(tài)釋放出來，釋放出這部分光的波長與入射光不同，稱作拉曼散射[1,3]。

拉曼圖譜是將拉曼散射中散射光和入射光之間的頻率改變轉(zhuǎn)化為圖譜形式，通常將拉曼散射的強(qiáng)度相對波長的函數(shù)圖稱為拉曼光譜。在拉曼圖譜中，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和核酸等生物大分子都有其對應(yīng)的頻移譜帶，通過分析這些譜帶的變化就可以獲取這些生物大分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，因此拉曼光譜又被稱為“分子指紋”[4]。

隨著儀器設(shè)備的不斷發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)也發(fā)展為顯微拉曼光譜技術(shù)、共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)等。顯微拉曼光譜技術(shù)是將顯微技術(shù)與拉曼光譜結(jié)合，可以檢測如單個細(xì)胞等微小樣本；共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)則是結(jié)合激光共聚焦原理能夠更加精確地檢測樣本的拉曼信號；表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)則是借助貴金屬表面特有的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)可以指數(shù)級地增強(qiáng)拉曼信號強(qiáng)度。隨著拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展，從對組織標(biāo)本的研究到單個細(xì)胞的檢測[5-6]，從對病變組織的檢測到臨床疾病診斷模型的建立[7-8]，從癌癥組織檢測到體液標(biāo)本的鑒定[9-10]，拉曼光譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，具有巨大的應(yīng)用潛力。

2 拉曼光譜在口腔醫(yī)學(xué)不同學(xué)科中的應(yīng)用

2.1 拉曼光譜在口腔內(nèi)科學(xué)中的應(yīng)用

Guze等[11]利用光導(dǎo)纖維探頭獲得51個健康志愿者（25個高加索人和26個亞洲人）口腔內(nèi)不同部位正常黏膜的拉曼光譜。他們使用785 nm、30 mW的近紅外激光在不同部位的口腔黏膜處照射1 s，獲得正常黏膜的拉曼光譜，結(jié)果顯示：口腔正常黏膜在1 665 cm-1附近有較強(qiáng)的峰值，其對應(yīng)的是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ；而在2 900 cm-1處的峰值則表示是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相關(guān)分子鍵的振動。該研究表明不同部位黏膜的拉曼光譜不同，主要跟黏膜的角化程度有關(guān)，而與年齡和性別無關(guān)。這項研究為拉曼光譜應(yīng)用于口腔黏膜疾病的臨床原位無創(chuàng)診斷打下基礎(chǔ)。

Zenone等[12]通過對新鮮的口腔天皰瘡黏膜標(biāo)本和正常黏膜標(biāo)本的顯微拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常黏膜，天皰瘡病變黏膜在644、1 234、1 423、1 657 cm-1處發(fā)生明顯改變，可以很好地鑒別天皰瘡黏膜組織和正常黏膜組織，具有高度靈敏性。進(jìn)一步研究[13]發(fā)現(xiàn)，天皰瘡患者和正常人血漿的拉曼光譜也存在差異；由于血漿獲取方便，可以借助拉曼光譜對天皰瘡等口腔黏膜疾病進(jìn)行鑒別診斷[13]。

舍格倫綜合征是一種自身免疫性疾病，其特征表現(xiàn)為外分泌腺如淚腺、唾液腺的進(jìn)行性破壞，導(dǎo)致眼干、口干為主要臨床表現(xiàn)的病征。舍格倫綜合征的臨床診斷主要依據(jù)唇腺活檢。薛麗麗等[14]通過對正常唇腺及病變唇腺的拉曼光譜進(jìn)行分析，確定了舍格倫綜合征病變唇腺光譜的診斷價值，并通過化學(xué)計量學(xué)建立診斷模型，可以很好地鑒別病變唇腺及正常唇腺，為拉曼光譜技術(shù)在舍格倫綜合征病變唇腺的檢測提供了可能。

在對牙齒礦化組織進(jìn)行的拉曼光譜研究中發(fā)現(xiàn)，在959 cm-1處有一個強(qiáng)峰值，其位置表示的是磷酸根的振動，此峰值強(qiáng)度從釉質(zhì)、釉牙本質(zhì)界到牙本質(zhì)逐漸減弱，按組織學(xué)上無機(jī)礦物質(zhì)從釉質(zhì)到牙本質(zhì)逐漸減少來分析，說明其峰值強(qiáng)度與磷酸鹽含量有關(guān)[15]。Ko等[16]在研究釉質(zhì)拉曼光譜時發(fā)現(xiàn)，釉質(zhì)光譜具有較強(qiáng)的偏振各向異性，而發(fā)生齲壞的釉質(zhì)的偏振各向異性較弱。正常釉質(zhì)在959 cm-1有較強(qiáng)的峰值，表示的是磷酸鹽的含量較高，而齲壞釉質(zhì)在959 cm-1峰值較正常釉質(zhì)弱，提示釉質(zhì)脫礦導(dǎo)致其磷酸鹽含量減少。Ko等[17]通過改進(jìn)拉曼光譜系統(tǒng)，利用光導(dǎo)纖維收集釉質(zhì)的拉曼光譜，取得了良好的效果，顯示了拉曼光譜診斷早期齲壞的潛力。

在牙周炎診斷方面，拉曼光譜技術(shù)也表現(xiàn)出巨大的潛力。Gonchukov等[18]對風(fēng)干的唾液進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可以很好地檢測出一些唾液中大分子生物標(biāo)志物，牙周炎患者唾液光譜中波數(shù)1 155、1 525、1 033和1 611 cm-1對應(yīng)的生物標(biāo)志物與正常對照組唾液有所不同，提示牙周炎患者唾液中類胡蘿卜素、糖蛋白、黏蛋白基質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生改變，可作為鑒別診斷依據(jù)將牙周炎患者與正常人群區(qū)分。

2.2 拉曼光譜在口腔材料學(xué)及修復(fù)科學(xué)中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新型醫(yī)用材料被應(yīng)用到口腔科學(xué)的臨床治療當(dāng)中，拉曼光譜為這些材料的研究提供了一種新方法。Gauthier等[19]通過分析拉曼光譜中二甲基丙烯酸單體中C=C雙鍵的強(qiáng)度來檢測樹脂的固化程度，結(jié)果表明：應(yīng)用拉曼光譜檢測樹脂固化程度的準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)方法一致，為檢測樹脂固化程度提供了新的便捷方法。Khalil等[20]和Cassoni等[21]分別應(yīng)用拉曼光譜對牙科復(fù)合樹脂的聚合程度進(jìn)行評價，均獲得了滿意的效果。復(fù)合樹脂粘接劑是通過滲透到經(jīng)酸蝕脫礦的牙本質(zhì)表面起到粘接作用的，應(yīng)用拉曼光譜和掃描電子顯微鏡技術(shù)，對比研究一步酸蝕法處理后樹脂滲透進(jìn)牙本質(zhì)的程度，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜可以準(zhǔn)確地反應(yīng)樹脂滲透的部位，對滲透深度的檢測較掃描電子顯微鏡更加準(zhǔn)確[22]。Lopes等[23]在研究激光對種植體周圍成骨性的生物調(diào)節(jié)作用時發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可以簡單準(zhǔn)確地評價種植體周圍的成骨量和骨質(zhì)量，這為種植體周圍骨愈合研究提供了一種新技術(shù)。

2.3 拉曼光譜在口腔頜面外科學(xué)中的應(yīng)用

口腔癌的發(fā)病率和死亡率在頭頸部惡性腫瘤中均比較高，能否早期診斷是決定預(yù)后的關(guān)鍵[24]。Oliveira等[24]和Malini等[25]通過對口腔黏膜組織切片的拉曼光譜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜能夠鑒別正常組織、炎癥組織、癌前病變和癌變組織。正常黏膜組織在1 750 cm-1處C=C和1 650 cm-1處C=O鍵的峰值弱且譜峰尖銳，1 080 cm-1處譜峰寬大，表明磷酸磷脂含量較高；而癌變組織在1 650、1450 cm-1處及1 200～1 350 cm-1處譜峰值強(qiáng)且譜帶寬大，這些分別表示酰胺Ⅰ、CH2和酰胺Ⅲ，說明癌變組織中蛋白質(zhì)含量明顯升高。還有學(xué)者[26]利用拉曼光譜對活體小鼠口腔上腭黏膜進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜對上腭黏膜各種程度的非典型增生及原位癌具有良好的鑒別能力，靈敏度和特異性均在90%以上，特別是對原位癌和重度非典型增生的鑒別靈敏度和特異性均為100%。Li等[27]對口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌和白斑病變組織的拉曼光譜進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常黏膜相比，癌變及白斑黏膜拉曼光譜中核酸及蛋白質(zhì)對應(yīng)的譜峰明顯增強(qiáng)，通過支持向量機(jī)建立鑒別診斷模型，診斷準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上。通過拉曼光譜對舌黏膜的原位癌和浸潤性鱗狀細(xì)胞癌的研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。在原位癌和浸潤性鱗狀細(xì)胞癌的拉曼光譜中，一些蛋白質(zhì)的相關(guān)譜峰較正常黏膜增強(qiáng)，可以用來作為鑒別正常組織與癌變組織的依據(jù)；通過統(tǒng)計分析，可以很好地將正常舌黏膜與癌變組織區(qū)分開來，準(zhǔn)確率達(dá)90%左右[28]。

腮腺腫瘤的術(shù)前診斷一直依賴于細(xì)針穿刺活檢技術(shù)，而Yan等[29]的研究為拉曼光譜技術(shù)用于腮腺腫瘤的鑒別診斷提供了理論基礎(chǔ)。Yan等[29]將腮腺多形性腺瘤、Warthin瘤及腮腺正常組織進(jìn)行拉曼光譜研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織中核酸和蛋白質(zhì)相關(guān)譜峰較正常組織增高，而正常腮腺中的脂類譜峰明顯高于腫瘤組織；以此作為診斷依據(jù)，通過支持向量機(jī)對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，成功鑒別出不同腫瘤及正常腮腺組織，其總體準(zhǔn)確率達(dá)95%以上。

放射性骨壞死或骨髓炎是頭頸部惡性腫瘤經(jīng)過放射治療后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。臨床上如果能早期鑒別出壞死骨組織和正常骨組織，不僅可以早期診斷，同時可以減少骨組織的切除范圍，為后期修復(fù)手術(shù)創(chuàng)造便利條件[1]。McCreadie等[30]對發(fā)生過骨折及正常的股骨頭組織標(biāo)本進(jìn)行拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生過骨折的標(biāo)本的骨組織成分與正常組有明顯差異，表明拉曼光譜可以鑒別骨組織內(nèi)的病理生理改變。Draper等[31]利用可穿透皮膚的拉曼光譜技術(shù)對小鼠骨骼進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)所得到的光譜與直接暴露的骨骼光譜相似。該技術(shù)是在普通拉曼光譜儀中加入濾波器，將皮膚和肌肉散射的拉曼光譜過濾掉，而只接收深層組織的拉曼光譜[31-32]。這項技術(shù)的應(yīng)用，使得拉曼光譜應(yīng)用于臨床檢測體內(nèi)深部組織或器官如骨骼組織等成為可能。Lakshmi等[4]在對下頜骨放射性骨壞死的研究中發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜對骨組織中礦物質(zhì)和有機(jī)物等成分的改變敏感，可以用來評價其有機(jī)和無機(jī)基質(zhì)的破壞或改變。該研究將正常骨組織、放射治療后骨組織和發(fā)生放射性骨壞死的骨組織進(jìn)行研究，拉曼光譜顯示：發(fā)生放射性骨壞死樣本的無機(jī)基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，膠原蛋白變性，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞減少；將所得的拉曼光譜通過主成分分析法進(jìn)行計算，3組之間的拉曼光譜存在明顯差異，提示拉曼光譜可以很好地鑒別經(jīng)過放射治療的骨組織是否發(fā)生放射性骨髓炎或骨壞死。

3 結(jié)束語

拉曼光譜的優(yōu)點如下：1）在病變組織尚未發(fā)生形態(tài)學(xué)改變時，拉曼光譜就可檢測出樣本中因細(xì)胞增殖、分化或惡變等引起的生物大分子結(jié)構(gòu)、成分和含量的改變，在腫瘤等疾病的早期診斷中有較高的優(yōu)勢；2）拉曼光譜可以實時、無創(chuàng)、快速對疾病進(jìn)行診斷和檢測，對檢測樣本無需特殊處理，方便快速，樣本可以反復(fù)使用，不僅可以檢測常規(guī)病變組織，還可以檢測骨骼和牙齒等高度礦化組織；3）拉曼光譜可以用于分析牙科材料的分子結(jié)構(gòu)和組成，為新材料分析研究提供有力幫助。綜上所述，拉曼光譜技術(shù)在口腔醫(yī)學(xué)中具有良好的應(yīng)用前景。

[1]Swinson B,Jerjes W,El-Maaytah M,et al.Optical techniques in diagnosis of head and neck malignancy[J].Oral Oncol,2006,42(3):221-228.

[2]Xue L,Sun P,Ou D,et al.Diagnosis of pathological minor salivary glands in primary Sjogren’s syndrome by using Raman spectroscopy[J].Lasers Med Sci,2014,29(2):723-728.

[3]Tunnell JW,Haka AS,McGee SA,et al.Diagnostic tissue spectroscopy and its applications to gastrointestinal endoscopy[J].Tech Gastrointest Endosc,2003,5(2):65-73.

[4]Lakshmi RJ,Alexander M,Kurien J,et al.Osteoradionecrosis(ORN)of the mandible:a laser Raman spectroscopic study[J].Appl Spectrosc,2003,57(9):1100-1116.

[5]von Rundstedt FC,Lerner SP.New imaging techniques for nonmuscle invasive bladder cancer[J].Curr Opin Urol,2014,24(5):532-539.

[6]Brauchle E,Thude S,Brucker SY,et al.Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy[J].Sci Rep,2014(4):4698.

[7]Wu X,Chen J,Li X,et al.Culture-free diagnostics of Pseudomonas aeruginosa infection by silver nanorod array based SERS from clinical sputum samples[J].Nanomedicine,2014,10(8):1863-1870.

[8]Lin D,Pan J,Huang H,et al.Label-free blood plasma test based on surface-enhanced Raman scattering for tumor stages detection in nasopharyngeal cancer[J].Sci Rep,2014(4):4751.

[9]Zhu MF,Ye XP,Huang YY,et al.Detection of methemoglobin in whole blood based on confocal micro-raman spectroscopy and multivariate statistical techniques[J].Scanning,2014,36(5):471-478.

[10]Guze K,Pawluk HC,Short M,et al.Pilot study:Raman spectroscopy in differentiating premalignant and malignant oral lesion from normal mucosa and benign lesions in humans[J].Head Neck,2014.doi:10.1002/head.23629.

[11]Guze K,Short M,Sonis S,et al.Parameters defining the potential applicability of Raman spectroscopy as a diagnostic tool for oral disease[J].J Biomed Opt,2009,14(1):014016.

[12]Zenone F,Lepore M,Perna G,et al.Micro-Raman spectroscopy on oral tissues[J].Proc of SPIE,2006:6137.doi:10.1117/12.651678.

[13]Zenone F,Lepore M,Perna G,et al.Oral pathology diagnosis by means of micro-Raman spectroscopy on biopsies and blood serum[J].Proc of SPIE,2007:6425.doi:10.1117/12.708142.

[14]薛麗麗,歐東晨,陳培瓊,等.原發(fā)性舍格倫綜合征病變唇腺的顯微拉曼光譜特征及診斷價值[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013,48(8):477-480.

[15]Schulze KA,Balooch M,Balooch G,et al.Micro-Raman spectroscopic investigation of dental calcified tissues[J].J Biomed Mater Res A,2004,69(2):286-293.

[16]Ko AC,Choo-Smith LP,Hewko M,et al.Detection of early dental caries using polarized Raman spectroscopy[J].Opt Express,2006,14(1):203-215.

[17]Ko AC,Hewko M,Sowa MG,et al.Early dental caries detection using a fibre-optic coupled polarization-resolved Raman spectroscopic system[J].Opt Express,2008,16(9):6274-6284.

[18]Gonchukov S,Sukhinina A,Bakhmutov D,et al.Raman spectroscopy of saliva as a perspective method for periodontitis diagnostics[J].Laser Physics Letter,2012,9(1):73-77.

[19]Gauthier MA,Stangel I,Ellis TH,et al.A new method for quantifying the intensity of the C=C band of dimethacrylate dental monomers in their FTIR and Raman spectra[J].Biomaterials,2005,26(33):6440-6448.

[20]Khalil SK,Allam MA,Tawfik WA.Use of FT-Raman spectroscopy to determine the degree of polymerization of dental composite resin cured with a new light source[J].Eur J Dent,2007,1(2):72-79.

[21]Cassoni A,Ferla Jde O,Shibli JA,et al.Knoop microhardness and FT-Raman spectroscopic evaluation of a resin-based dental material light-cured by an argon ion laser and halogen lamp:anin vitrostudy[J].Photomed Laser Surg,2008,26(6):531-539.

[22]Sato M,Miyazaki M.Comparison of depth of dentin etching and resin infiltration with single-step adhesive systems[J].J Dent,2005,33(6):475-484.

[23]Lopes CB,Pinheiro AL,Sathaiah S,et al.Infrared laser photobiomodulation(lambda 830 nm)on bone tissue around dental implants:a Raman spectroscopy and scanning electronic microscopy study in rabbits[J].Photomed Laser Surg,2007,25(2):96-101.

[24]Oliveira AP,Bitar RA,Silveira L,et al.Near-infrared Raman spectroscopy for oral carcinoma diagnosis[J].Photomed Laser Surg,2006,24(3):348-353.

[25]Malini R,Venkatakrishna K,Kurien J,et al.Discrimination of normal,inflammatory,premalignant,and malignant oral tissue:a Raman spectroscopy study[J].Biopolymers,2006,81(3):179-193.

[26]Bakker Schut TC,Witjes MJ,Sterenborg HJ,et al.In vivodetection of dysplastic tissue by Raman spectroscopy[J].Anal Chem,2000,72(24):6010-6018.

[27]Li Y,Wen Z,Li L,et al.Research on the Raman spectral character and diagnostic value of squamous cell carcinoma of oral mucosa[J].J Raman Spectrosc,2010(41):142-147.

[28]Devpura S,Thakur JS,Sethi S,et al.Diagnosis of head and neck squamous cell carcinoma using Raman spectroscopy:tongue tissues[J].J Raman Spectrosc,2012(43):490-496.

[29]Yan B,Li Y,Yang G,et al.Discrimination of parotid neoplasms from the normal parotid gland by use of Raman spectroscopy and support vector machine[J].Oral Oncol,2011,47(5):430-435.

[30]McCreadie BR,Morris MD,Chen TC,et al.Bone tissue compositional differences in women with and without osteoporotic fracture[J].Bone,2006,39(6):1190-1195.

[31]Draper ER,Morris MD,Camacho NP,et al.Novel assessment of bone using time-resolved transcutaneous Raman spectroscopy[J].J Bone Miner Res,2005,20(11):1968-1972.

[32]Matousek P,Stone N.Emerging concepts in deep Raman spectroscopy of biological tissue[J].Analyst,2009,134(6):1058-1066.