張悅　李丹　陳子?！↑S曉雯

摘要：對(duì)昆明市宜良縣玫瑰發(fā)病植株上分離獲得的1個(gè)灰葡萄孢菌株和1個(gè)昆明本地土壤中分離的黃曲霉菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，昆明花卉致病灰葡萄孢菌株在4～25 ℃條件下均可生長(zhǎng)，在25 ℃下生長(zhǎng)速度最快，4 ℃時(shí)相對(duì)較慢，而在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)幾乎停止；黃曲霉在4 、37 ℃時(shí)生長(zhǎng)均受到明顯抑制，只在25 ℃時(shí)才能正常生長(zhǎng)，表明黃曲霉菌株對(duì)溫度要更加敏感；pH值對(duì)于灰葡萄孢菌株的生長(zhǎng)影響相對(duì)較小，灰葡萄孢在偏酸環(huán)境中生長(zhǎng)較快；pH值對(duì)于黃曲霉菌株的生長(zhǎng)影響較大，黃曲霉在中性及偏堿環(huán)境中生長(zhǎng)明顯較快；光照對(duì)灰葡萄孢菌株生長(zhǎng)的影響大于黃曲霉菌株，這可能和黃曲霉腐生于土壤，對(duì)光照刺激不敏感有關(guān)；2種菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況表明，兩者都可以利用葡萄糖、蔗糖為碳源生長(zhǎng)，碳源對(duì)灰葡萄孢菌株生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響，而黃曲霉利用葡萄糖的能力要強(qiáng)于蔗糖，因此高葡萄糖環(huán)境可能更易于黃曲霉生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：灰葡萄孢；黃曲霉；溫度；pH值；光照；培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0118-03

灰葡萄孢是灰霉病的病原菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在氣候涼爽潮濕的地區(qū)為害尤為嚴(yán)重[1]。它是一類侵染性很強(qiáng)的以腐生為主的真菌，可以侵染200多種植物，其中包括云南省經(jīng)常種植的花卉、葡萄、番茄、草莓、蔬菜等多種經(jīng)濟(jì)作物。除了能引起田間損失，灰葡萄孢在果實(shí)的儲(chǔ)存和運(yùn)輸中也會(huì)造成嚴(yán)重危害，使果實(shí)的儲(chǔ)存期變短、品質(zhì)變差，帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。

曲霉屬真菌是自然界分布最普遍的腐生菌之一，能使農(nóng)產(chǎn)品變質(zhì)、霉壞，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。據(jù)報(bào)道土壤中的曲霉資源較為豐富[6]，劉艷梅等曾從甘肅省土壤中分離得到了7個(gè)種和3個(gè)變種的曲霉菌種[7]。作為貯藏物污染菌，黃曲霉是曲霉屬中非常常見(jiàn)的一個(gè)種類，其存在于土壤和各類動(dòng)植物中。此前，有研究發(fā)現(xiàn)不同溫度對(duì)番茄灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響很大，其孢子的萌發(fā)適溫在15～ 25 ℃，最適溫度為20 ℃，30 ℃以上病害發(fā)展受到抑制。低溫有利于病菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢最適溫度為15 ℃[8]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)番茄灰葡萄孢喜偏酸性的環(huán)境，其在pH值3～11的范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，pH值為6時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快、產(chǎn)孢量最高[9-10]。黃曲霉是溫暖地區(qū)常見(jiàn)的占優(yōu)勢(shì)的霉菌，菌落生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)10～14 d，其直徑可達(dá)6～7 cm[11]。

本研究以昆明本地分離得到的玫瑰致病灰葡萄孢菌株和土壤黃曲霉菌株為研究材料，分析其在不同溫度、pH值、光照及培養(yǎng)基等環(huán)境條件下生長(zhǎng)情況，明確昆明本地致病灰葡萄孢、黃曲霉菌株的生物學(xué)特性，為了解昆明本地灰葡萄孢、黃曲霉菌株環(huán)境適應(yīng)能力以及制定合理防治策略提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 灰葡萄孢、黃曲霉菌株的分離、純化與鑒定

供試灰葡萄孢菌株采集自昆明市宜良縣發(fā)病玫瑰，黃曲霉菌株取樣分離于昆明本地土壤。試驗(yàn)用灰葡萄孢菌株采用組織分離法對(duì)病原菌分離，黃曲霉菌株則采用常規(guī)土壤微生物分離方法分離。此后，得到的各菌株采用已報(bào)道方法[12]進(jìn)一步進(jìn)行單孢分離，最終按《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定。

1.2 培養(yǎng)基的制備

本試驗(yàn)共采用了3種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的成分如下。PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯40 g、葡萄糖4 g、瓊脂4 g、水200 mL；清水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂4 g、水200 mL；PSA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯40 g、蔗糖4 g、瓊脂4 g、水200 mL。

1.3 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

用滅菌打孔器（直徑5 mm）取灰葡萄孢菌株、黃曲霉菌株菌落邊緣的菌塊，移植到PDA平板培養(yǎng)基中央，分別置于各處理溫度下的恒溫箱中培養(yǎng)，每24 h測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.4 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)pH值梯度：5、6、7、8，將熔化好的PDA培養(yǎng)基用1 mol/L鹽酸或1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)到所需pH值后（以精密試紙測(cè)定），倒平板備用。將灰葡萄孢菌株、黃曲霉菌株分別接種到PDA平板上活化后，用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔，挑取菌片置于不同pH值的平板中央，在25 ℃下培養(yǎng)，每24 h測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

1.5 光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)處理：全光照、全黑暗。將灰霉菌株、黃曲霉菌株接種到PDA平板上活化后，用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔，挑取菌片置于PDA平板培養(yǎng)基中央，在試驗(yàn)設(shè)定的條件下于25 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h測(cè)定菌落的直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

1.6 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基設(shè)3種處理：PDA培養(yǎng)基、清水瓊脂培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基。將灰葡萄孢菌株、黃曲霉菌株接種至PDA平板上活化后，用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔，挑取菌片置于平板中央，在設(shè)定的25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每24 h測(cè)定菌落的直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢、黃曲霉菌株菌落的特征觀察

通過(guò)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢菌株在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，菌絲初期為白色或淺灰色，呈現(xiàn)出致密的絨毛狀且緊挨培養(yǎng)基生長(zhǎng)。菌絲產(chǎn)孢后，培養(yǎng)皿邊緣的菌絲顏色開(kāi)始逐漸由白色向灰色或灰褐色轉(zhuǎn)變，菌絲生長(zhǎng)繁茂但較短。

黃曲霉分離菌株培養(yǎng)初期為灰白色、扁平，之后出現(xiàn)放射狀溝紋，菌落顏色轉(zhuǎn)為黃至暗綠色，菌落背面無(wú)色至淡紅色。菌株頂囊大、球狀；小梗1～2層，布滿整個(gè)頂囊表面。菌絲為有隔菌絲，分生孢子球形或近似梨形，表面粗糙。

2.2 灰葡萄孢、黃曲霉菌株生物學(xué)特性的比較研究

2.2.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在不同溫度處理下昆明地區(qū)分離的致病灰葡萄孢、土壤黃曲霉菌株的菌落生長(zhǎng)速率有明顯的不同。2種真菌在溫度為4～25 ℃的區(qū)間內(nèi)都能生長(zhǎng)。灰葡萄孢在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)受到較大的抑制；而黃曲霉在4、37 ℃時(shí)生長(zhǎng)受到抑制（圖1）。

通過(guò)試驗(yàn)分析表明，灰葡萄孢菌株菌絲雖然在4～37 ℃的溫度區(qū)間都可以生長(zhǎng)，但是生長(zhǎng)環(huán)境的溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生較大的影響，而最佳生長(zhǎng)溫度為25 ℃。溫度對(duì)黃曲霉菌株生長(zhǎng)的影響明顯較灰葡萄孢大，過(guò)低或過(guò)高的溫度都會(huì)抑制黃曲霉生長(zhǎng)。

2.2.2 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 圖2、圖3結(jié)果表明，昆明花卉致病灰葡萄孢、土壤黃曲霉菌株在pH值5～8的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，但在不同pH值的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率具有一定的差異，而黃曲霉菌株的差異更為明顯。在pH值為6時(shí)，灰葡萄孢菌株生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑也最大。而黃曲霉菌株在pH值為7時(shí)生長(zhǎng)速率最快，pH值為8時(shí)次之，pH值為5、6時(shí)則生長(zhǎng)速率明顯慢得多。因此，pH值對(duì)于灰葡萄孢菌株的生長(zhǎng)影響相對(duì)較小，與灰葡萄孢在偏酸環(huán)境中生長(zhǎng)相對(duì)較快的報(bào)道一致。pH值對(duì)于黃曲霉菌株的生長(zhǎng)影響較大，黃曲霉在中性及偏堿環(huán)境中生長(zhǎng)明顯較快 。

2.2.3 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 光照情況對(duì)昆明花卉致病灰葡萄孢菌株、土壤黃曲霉菌株生長(zhǎng)也有一定的影響。無(wú)論是在全黑暗還是在全光照條件下，灰葡萄孢菌株的生長(zhǎng)速率均快于黃曲霉；全黑暗條件下，灰葡萄孢菌株生長(zhǎng)速率明顯要快于全黑暗條件；黃曲霉菌株則相反，黑暗培養(yǎng)時(shí)，菌株生長(zhǎng)速率略快于全光照時(shí)的生長(zhǎng)速率，但差異并不非常明顯（圖4）。由此可見(jiàn)，光照條件對(duì)灰葡萄孢菌株生長(zhǎng)的影響要大于對(duì)黃曲霉菌株的影響。

2.2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 昆明花卉致病灰葡萄孢菌株、土壤黃曲霉菌株在PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、清水培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。但無(wú)論在PDA還是PSA培養(yǎng)基中，灰葡萄孢菌株的生長(zhǎng)速率都明顯快于黃曲霉，且灰葡萄孢在2種培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)速率沒(méi)有明顯差異，表明該菌株能有效利用葡萄糖、蔗糖作碳源正常生長(zhǎng)。黃曲霉在PSA培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)速率要比在PDA培養(yǎng)基中的略慢，表明其利用葡萄糖的能力要強(qiáng)于蔗糖（圖5）。與預(yù)期一樣，在無(wú)額外碳源的清水培養(yǎng)基中，2個(gè)菌株的生長(zhǎng)速率都非常緩慢，明顯無(wú)法正常生長(zhǎng)。

3 討論

灰葡萄孢適應(yīng)性較強(qiáng)，是薔薇科花卉常見(jiàn)的一種致病真菌。黃曲霉是一種常見(jiàn)土壤腐生真菌，由于其分泌的毒素對(duì)人體有一定危害，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中受到了較高的關(guān)注。溫度試驗(yàn)表明，昆明花卉致病灰葡萄孢菌株在4～37 ℃下均可生長(zhǎng)，但在25 ℃下生長(zhǎng)速度最快，4 ℃時(shí)相對(duì)較慢，在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)幾乎停止；而黃曲霉在4 、37 ℃時(shí)生長(zhǎng)均受到明顯抑制，只在25 ℃時(shí)正常生長(zhǎng)，表明黃曲霉菌株對(duì)溫度要更加敏感。因此，陰冷的天氣最有利于玫瑰致病灰葡萄孢菌株的生長(zhǎng)。昆明市每年春夏雨季氣溫在25 ℃左右時(shí)，都是監(jiān)測(cè)玫瑰灰霉病的關(guān)鍵時(shí)期；當(dāng)氣溫高于30 ℃以上時(shí)，可相對(duì)減少對(duì)灰葡萄孢病害的監(jiān)測(cè)。

此外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在pH值為5～8時(shí)，灰葡萄孢、黃曲霉菌株都可以生長(zhǎng)，但pH值對(duì)于灰葡萄孢菌株的生長(zhǎng)影響相對(duì)較小，灰葡萄孢在偏酸環(huán)境中生長(zhǎng)相對(duì)較快。pH值對(duì)于黃曲霉菌株的生長(zhǎng)影響較大，黃曲霉在中性及偏堿環(huán)境中生長(zhǎng)明顯較快，這表明2種真菌在適應(yīng)微環(huán)境的酸堿度上還是有明顯差異。另外，光照對(duì)灰葡萄孢菌株生長(zhǎng)的影響要大于黃曲霉菌株，這可能和黃曲霉腐生于土壤，對(duì)光照刺激不敏感有關(guān)。培養(yǎng)基試驗(yàn)表明，2種真菌都可以利用葡萄糖、蔗糖為碳源生長(zhǎng)，但2種碳源差異對(duì)灰葡萄孢菌株幾乎沒(méi)有影響，黃曲霉利用葡萄糖的能力要強(qiáng)于蔗糖，因此高葡萄糖環(huán)境可能更易于黃曲霉生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cotoras M，Silva E. Differences in the initial events of infection of Botrytis cinerea strains isolated from tomato and grape[J]. Mycologia，2006，97（2）：485-492.

[2]紀(jì)明山，祁之秋，王英姿，等. 番茄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2003，31（4）：396-400.

[3]Williamson B，Tudzynski B，Tudzynski P，et al. Botrytis cinerea： the cause of grey mould disease[J]. Molecular Plant Pathology，2007，8（5）： 561-580.

[4]Staats M，van Baarlen P，van Kan J A. Molecular phylogeny of the plant pathogenic genus Botrytis and the evolution of host specificity[J]. Molecular Biology and Evolution，2005，22（2）：333-346.

[5]Horn W B. Ecology and population biology of aflatoxigenic fungi in soil[J]. Toxin Reviews，2003，22（2/3）： 351-379.

[6]李冬梅，王端禮，李若瑜，等. 我國(guó)北方地區(qū)裸胞殼屬的種[J]. 菌物系統(tǒng)，1998，17（2）：130-136.

[7]劉艷梅，朱建蘭. 甘肅省土壤曲霉屬（Aspergillus Mich.ex Link：Fr.）的種[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（4）：145-148，157.

[8]李寶聚，陳立芹，孟偉軍，等. 溫度調(diào)控對(duì)番茄灰霉病菌侵染的影響[J]. 植物保護(hù)，2004，30（2）：75-80.

[9]馬輝剛，李瑞明，胡水秀. 番茄灰霉病菌生物學(xué)特性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，20（2）：57-59.

[10]朱建蘭. 番茄灰霉病菌的生物學(xué)特性研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30（1）：73-78.

[11]Angle J S，Dunn K A，Wagner G H，et al. Effect of cultural practices on the soil populations of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus[J]. Soil Science Society of America Journal，1982，46： 301-304.

[12]楊婉琴. 一種簡(jiǎn)便的單孢分離法[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，1993，6（2）：234.