馬海艷,周賀,高養(yǎng)春,孫效文,魯翠云,曹頂臣,江振華

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧 大連116023;2.中國水產(chǎn)科學研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

銀鯽與普通鯽早期胚胎發(fā)育的比較研究

馬海艷1,周賀1,高養(yǎng)春1,孫效文2,魯翠云2,曹頂臣2,江振華1

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧 大連116023;2.中國水產(chǎn)科學研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

為了解黑龍江水系銀鯽Carassius auratus gibelio和普通鯽C.auratus auratus的胚胎發(fā)育過程,對銀鯽(3n♀×3n♂,SS)和普通鯽 (2n♀×2n♂,DD)的胚胎發(fā)育過程進行了比較觀察。結(jié)果表明:SS(DD)成熟的卵子呈淺黃色,卵膜透明,圓形,有黏性,卵徑為1.3～1.7 mm(1.2～1.6 mm);水溫為 (23± 1)℃條件下,SS(DD)受精后1 h 08 min(1 h 03 min)進入卵裂期,受精后2 h 54 min(5 h 02 min)進入囊胚期,受精后8 h 06 min(6 h 49 min)進入原腸胚期,受精后10 h 25 min(10 h 51 min)進入神經(jīng)胚期,受精后14 h 22 min(16 h 20 min)進入器官形成期,59 h 31 min(59 h 05 min)后出膜。研究表明,SS和DD均具有正常的早期胚胎發(fā)育過程,這為進一步了解SS和DD的遺傳背景和生殖方式提供了生物學依據(jù)。

銀鯽;普通鯽;胚胎發(fā)育

鯽Carassius auratus主要分布于亞洲和歐洲。中國的銀鯽主要分布于黑龍江流域和新疆等地,在其他水域也發(fā)現(xiàn)有染色體數(shù)為150～166的云南高背鯽、淇河鯽、彭澤鯽、普安鯽等三倍體種群。沈俊寶等[1]依據(jù)形態(tài)學和染色體數(shù)目將黑龍江水系的鯽分為兩個亞種:一個是染色體數(shù)目為100的鯽亞種,主要分布于江河;另一個是染色體數(shù)目為150左右的銀鯽,主要分布于大型湖泊水庫。銀鯽具有雌核發(fā)育和兩性生殖兩種生殖方式。銀鯽卵子與異源精子受精行雌核發(fā)育,而與同源精子受精則行兩性生殖[2-5]。關(guān)于銀鯽的起源與進化,目前有兩種觀點:一種認為銀鯽是二倍體鯽與鯉雜交而來的[6-7];另一種認為黑龍江銀鯽是在特殊地理和環(huán)境下 (冰封等),由二倍體鯽進化而來的,是二倍體鯽在特殊環(huán)境下對不良環(huán)境的一種適應(yīng)結(jié)果[1]。孫效文等[8]報道了銀鯽與普通鯽存在著明顯的遺傳物質(zhì)交流,較高的遺傳相似性不僅與傳統(tǒng)的銀鯽起源于普通鯽的觀點一致,也暗示銀鯽與普通鯽存在經(jīng)常性的遺傳物質(zhì)交流。但有關(guān)黑龍江水系銀鯽和普通鯽胚胎發(fā)育的研究至今尚未見報道。本研究中,對黑龍江水系銀鯽Carassius auratus gibelio(3n♀×3n♂)和普通鯽C.auratus auratus(2n♀×2n♂)的胚胎發(fā)育過程進行了比較觀察,旨在為進一步了解該魚的遺傳背景及其生殖方式提供生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用銀鯽和普通鯽由黑龍江水產(chǎn)研究所松浦試驗站提供。銀鯽體長為29.2 cm,體質(zhì)量為660 g;普通鯽體長為20 cm,體質(zhì)量為190 g。染色體倍性經(jīng)流式細胞儀檢測確定,銀鯽為三倍體,普通鯽為二倍體。

1.2 方法

1.2.1 人工催產(chǎn)及授精 選取發(fā)育良好的黑龍江水系銀鯽和普通鯽進行催產(chǎn),注射A2+DOT[雌性注射劑量:A2為4μg/kg(體質(zhì)量),DOT為1 mg/kg(體質(zhì)量),雄性減半],水溫為 (23± 1)℃,效應(yīng)時間為6～7 h,確認排卵后,輕壓腹部采卵到直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,雄魚同樣輕壓腹部用毛細管采精。干法授精,配制2n♀×2n♂(DD)和3n♀×3n♂ (SS)雜交組合。

1.2.2 幼魚培育 幼魚培育溫度為 (23±1)℃,每天兩次更換曝氣水,及時挑出死卵。

1.2.3 胚胎發(fā)育觀察 受精后按照各個發(fā)育時期定期取樣,每個時期取樣30個,發(fā)育時序以50%的胚胎發(fā)育至某個時期的時間計算,用LY-WNHPCCD進行顯微觀察及拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在原腸晚期統(tǒng)計受精率,即受精卵數(shù)占總卵數(shù)的百分比。在孵出前期統(tǒng)計孵化率,即孵化出的苗數(shù)占受精卵總數(shù)的百分比。孵化出7 d時統(tǒng)計成活率,即成活胚胎占受精卵總數(shù)的百分比。采用SPSS 15.0軟件進行顯著性檢驗,顯著性水平設(shè)為0.05,極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期的發(fā)育特征

在培育水溫為 (23±1)℃時,黑龍江水系銀鯽和二倍體鯽的胚胎發(fā)育時序可分為6個階段共25個時期。

2.1.1 受精卵 SS(DD)成熟卵子呈淺黃色,圓形,有黏性,卵質(zhì)分布均勻,卵徑為1.3～1.7 mm (1.2～1.6 mm)。卵子受精后卵膜吸水膨脹,卵周隙明顯擴大 (表1,圖1-A,圖2-A)。SS(DD)受精后50 min(39 min),卵子細胞質(zhì)向動物極集中,逐漸隆起,形成胚盤,約占卵球高度的1/3 (表1,圖1-B,圖2-B)。

2.1.2 卵裂期 SS(DD)受精后1 h 08 min(1 h 03 min),卵子動物極出現(xiàn)裂紋,胚盤縱裂成2個大小相似的分裂球,為2細胞期 (表1,圖1-C,圖2-C);受精后1 h 18 min(1 h 25 min),出現(xiàn)第二次卵裂,沿第一次分裂垂直的方向進行第二次縱裂,形成4個大小相同的分裂球,進入4細胞期(表1,圖1-D,圖2-D);受精后1 h 21 min(1 h 57 min),胚盤進行第3次縱裂,分裂溝與第1次平行且位于其兩側(cè),形成8個分裂球,排成兩行,中間4個大,兩側(cè)4個小,進入8細胞期 (表1,圖1-E,圖2-E);受精后1 h 33 min(2 h 10 min),胚盤進行第四次縱裂,在第二次分裂面的兩側(cè)分別產(chǎn)生與之平行的分裂溝,形成大小相近的16個細胞,胚盤進入16細胞期 (表1,圖1-F,圖2-F);受精后1 h 59min(3 h 20min),胚盤進行第五次縱裂,形成32個大小不等的細胞,細胞排列不規(guī)則,邊緣的細胞略大,胚盤進入32細胞期 (表1,圖1-G,圖2-G);受精后2 h 10 min (4 h 03 min),卵裂向多個方向進行,細胞數(shù)量逐漸增多,細胞界限分辨不清,分裂球越來越小,進人多細胞期 (表1,圖1-H,圖2-H)。

2.1.3 囊胚期 SS(DD)受精后2 h 54 min(5 h 02 min),細胞繼續(xù)分裂,分裂球越來越小,分裂溝模糊不清,胚盤高聳于卵黃上方,占卵的1/2,進入囊胚早期 (表1,圖1-I,圖2-I);受精后2 h 59 min(5 h 48 min),細胞繼續(xù)分裂,囊胚細胞開始向下方擴展而變得稍扁平,囊胚層較囊胚早期為低,已看不清細胞界限,進入囊胚中期 (表1,圖1-J,圖2-J);受精后4 h 24min(6 h 13min),胚層繼續(xù)向下擴展,開始產(chǎn)生下包作用,此時胚盤變成弓狀,進入囊胚晚期 (表1,圖1-K,圖2-K)。

2.1.4 原腸期 SS(DD)受精后8 h 06 min(6 h 49 min),囊胚層細胞繼續(xù)下包卵黃1/3且內(nèi)卷形成胚環(huán),進入原腸早期 (表1,圖1-L,圖2-L);受精后8 h 52 min(8 h 31 min),囊胚下包卵黃1/ 2,進入原腸中期 (表1,圖1-M,圖2-M);受精后10 h 10 min(9 h 37 min),囊胚下包卵黃2/3,進入原腸晚期 (表1,圖1-N,圖2-N)。

2.1.5 神經(jīng)胚期 SS(DD)受精后10 h 25 min (10 h 51 min),胚層細胞繼續(xù)下包約4/5,胚孔尚未閉合,胚環(huán)明顯縮小,進入神經(jīng)胚期 (表1,圖1-O,圖2-O);受精后11 h 28 min(13 h 17 min),胚孔閉合,胚體呈弧形,胚盤完全包裹卵黃,進入胚孔封閉期 (表1,圖1-P,圖2-P)。

2.1.6 肌節(jié)出現(xiàn)及尾泡形成階段 SS(DD)受精后13 h 18 min(13 h 42 min),胚孔封閉后軀干中段出現(xiàn)2對肌節(jié),進入肌節(jié)出現(xiàn)期 (表1,圖1-Q,圖2-Q);受精后13 h 30 min(13 h 44 min),可觀察到4對肌節(jié),胚體尾部上出現(xiàn)圓形亮點,即尾泡,進入尾泡形成期 (表1,圖1-R,圖2-R)。

2.1.7 器官形成期 SS(DD)受精后14 h 22min (16 h 20 min),腦已分化為前、中、后3部分,前段透明囊泡為眼囊,進入眼囊期 (表1,圖1-S,圖2-S);受精后16 h 57min(16 h 15min),眼囊前傾,在其下方可觀察到暗色斑塊狀的嗅囊,即進入嗅囊出現(xiàn)期 (表1,圖1-T,圖2-T);受精后17 h 03 min(17 h 41 min),尾部變圓,出現(xiàn)錐形尾芽,進入尾芽出現(xiàn)期 (表1,圖1-U,圖2-U);受精后18 h 10 min(18 h 54 min),出現(xiàn)透明的泡狀耳囊,進入耳囊形成期 (表1,圖1-V,圖2-V);受精后21 h 05 min(22 h 37 min),可觀察到22對肌節(jié),胚體的中段出現(xiàn)不連續(xù)性的肌肉收縮,進入肌肉效應(yīng)期 (表1,圖1-W,圖2-W);受精后24 h 40 min(27 h 47 min),心臟原基開始有節(jié)律的跳動,進入心跳期 (表1,圖1-X,圖2-X)。

2.1.8 出膜階段 SS(DD)受精后59 h 31 min (59 h 05min),尾部開始出現(xiàn),與體軸形成一條直線,頭部仍然在卵膜內(nèi),進入出膜期 (表 1,圖1-Y,圖2-Y)。

表1 銀鯽和普通鯽的早期胚胎發(fā)育時程Tab.1 Embryonic development of silver crucian carp Carassius auratus gibelio and crucian carp C.auratus auratus

2.2 銀鯽和普通鯽的受精率及孵化率

由表2可知,銀鯽和普通鯽的平均受精率分別為 65.90%、89.21%,平 均 孵 化 率 分 別 為48.89%、77.58%。銀鯽和普通鯽的受精率、孵化率和7日成活率均有極顯著性差異(P＜0.01)。

表2 銀鯽和普通鯽雜交受精率、孵化率及成活率 (平均值±標準差)Tab.2 The egg number,fertilization rate,hatching rate and survival rate of the hybrids between silver crucian carp Carassius auratus gibelio(SS)and crucian carp C.auratus auratus(DD)(mean±S.D.) %

圖1 銀鯽的胚胎發(fā)育觀察Fig.1 Embryonic development of silver crucian carp Carassius auratus gibelio

3 討論

3.1 銀鯽與普通鯽的生殖方式

在黑龍江水系中存在兩種鯽,一種為三倍體銀鯽,另一種為二倍體普通鯽。黑龍江水系的銀鯽與日本和東歐的銀鯽一樣,是一個天然雌核發(fā)育種群[9-10],因而所產(chǎn)生的后代與母本相似。二倍體普通鯽須通過雌雄兩性配子的結(jié)合才能夠繁殖后代,雌、雄比例正常[11]。雌核發(fā)育銀鯽的另一個特殊現(xiàn)象就是在天然群體中,有5%～20%的雄性個體產(chǎn)生,而且雄性個體的比例與精子的來源密切相關(guān)。蔣一珪等[12]發(fā)現(xiàn),異源精子產(chǎn)生的后代全為雌性,精子的親緣關(guān)系越近,雄性的比例就越大。用親緣越近的精子受精,精子的解凝程度越大,父本遺傳物質(zhì)進入子代就越多,子代中雄魚也就越多。這與銀鯽的異精效應(yīng) (父本的性狀會在銀鯽子代中有一定的體現(xiàn))應(yīng)該是同一個原理。楊潔等[11]研究表明,三倍體銀鯽的精巢能夠發(fā)育成熟,能產(chǎn)生正常的精子。據(jù)報道銀鯽具有雙重生殖方式,即雌性生殖和有性生殖。當銀鯽卵子與異源精子受精時,產(chǎn)生與母本性狀完全一致的全雌后代;而當銀鯽卵子與同源精子受精時,卵子進行有性生殖,產(chǎn)生具有父母本遺傳物質(zhì)的雌性和雄性后代[13]。本研究結(jié)果也證實,銀鯽卵子與銀鯽精子能正常受精,并且具有正常的早期胚胎發(fā)育過程。

圖2 普通鯽的胚胎發(fā)育觀察Fig.2 Embryo development of crucian carp Carassius auratus auratus

3.2 銀鯽與普通鯽胚胎發(fā)育的比較

近年來,國內(nèi)有關(guān)魚類胚胎發(fā)育的研究已有不少報道,主要集中在中國特殊的魚種和經(jīng)濟魚種。而對鯽的胚胎發(fā)育鮮有報道。如表3所示,早在20世紀50年代,李璞等[14]報道了鯽和紅鯽的胚胎發(fā)育速度及時序相同,在 (24.5±1)℃恒溫條件下,從受精卵開始到孵化歷經(jīng)65 h。王冬武等[15]報道了芙蓉鯽受精卵胚胎在21～23℃水溫條件下, 65 h開始出膜。梁正其等[16]報道了普安銀鯽胚胎發(fā)育過程可分為23個發(fā)育期,水溫18℃時需98.72 h出膜,水溫24、26℃時分別需要56.30、48.2 h出膜。本研究中,對銀鯽及普通鯽的早期胚胎發(fā)育進行觀察比較,結(jié)果表明,銀鯽與普通鯽的胚胎發(fā)育在外觀上無明顯差異,胚胎發(fā)育正常,發(fā)育時序基本相同。但從受精卵到胚盤形成銀鯽比普通鯽慢,到卵裂期銀鯽明顯比普通鯽快。在(23±1)℃水溫下,從受精到孵化,銀鯽和普通鯽歷經(jīng)時間分別為59 h 31 min和59 h 05 min,二者差別不明顯,但明顯比芙蓉鯽快。分析原因一方面與溫度有關(guān),另一方面可能是不同種類胚胎發(fā)育速度不同所致。銀鯽和普通鯽的受精率、孵化率和7日成活率均有極顯著性差異 (P＜0.01),由此可認為,銀鯽染色體組數(shù)目的增加,對受精率、孵化率和7日成活率有一定的影響。

表3 鯽發(fā)育時序的研究結(jié)果匯總Tab.3 Summary of the embryonic development in crucian carp Carassius auratus

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Com parative observation of embryonic development of silver crucian carp Carassius auratus gibelio and crucian carp Carassius auratus auratus

MA Hai-yan1,ZHOU He1,GAO Yang-chun1,SUN Xiao-wen2, LU Cui-yun2,CAO Ding-chen2,JIANG Zhen-hua1
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

Themorphological characteristics of embryonic developmentwere observed in diploid crucian carp Carassius auratusauratus(2n♀×2n♂,DD)and silver crucian carp C.auratusgibelio(3n♀×3n♂,SS)in Heilongjiang River.The SS(DD)had yellow round adhensive mature eggs with transparentmembrane,and egg diameter of 1.3-1.7 mm(1.2-1.6 mm).The fertilized eggs from SS(DD)developed into cleavage stage 1 h 08 min(1 h 03 min)after fertilization at(23±1)℃.At the same conditions,blastula stage appear 2 h 54 min(5 h 02 min)after fertilization,gastrula stage appear 8 h 06 min(6 h 49 min)after fertilization,neurula stage was observed 10 h 25 min(10 h 51 min)after fertilization,organogenesis stage was noticed 14 h 22 min(16 h 20 min)after fertilization, and hatching stage was observed 59 h 31 min(59 h 05 min)after fertilization.The findings indicated that SS and DD had normal early embryonic development,provided an evidence to understand the genetic background and reproduction for SS and DD.

Carassius auratus gibelio;Carassius auratus auratus;embryonic development

S965.117

A

2015-05-25

淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室開放課題 (NLJEL-FFB-01)

馬海艷 (1990—),女,碩士研究生。E-mail:724479732@qq.com

周賀 (1985—),女,博士,講師。E-mail:zhouhe@dlou.edu.cn

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2015.05.004

2095-1388(2015)05-0472-06