孫道華， 劉兆巖，肖正梨，鄭艷梅，黃加樂(lè)，李清彪,

（1廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程與生物工程系，福建 廈門 361005； 2泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000）

引 言

紡織品在醫(yī)藥、保健、衛(wèi)生以及運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域的快速發(fā)展，引起了抗菌整理的熱潮[1]。在紡織材料上微生物的生長(zhǎng)不但會(huì)對(duì)織物本身造成損害，而且會(huì)影響織物的舒適度[2]。多種抗菌劑如金屬鹽、季銨化合物、過(guò)氧酸等都應(yīng)用于織物的抗菌整理中[3]。其中，納米銀由于其良好的抑菌效果、不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)受到了關(guān)注[4-6]。

目前納米銀的制備方法以化學(xué)法為主，包括溶膠-凝膠法、水熱法、微乳液法等。該法工藝較為靈活，操作簡(jiǎn)單，容易控制，在粒徑和形貌的控制上較為成熟。缺點(diǎn)是過(guò)程所使用的化學(xué)試劑在一定程度上會(huì)污染環(huán)境，部分穩(wěn)定劑或分散劑甚至有致癌性。新興的植物還原法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的制備金屬納米顆粒的方法，利用植物質(zhì)或植物提取液中的活性成分的物理化學(xué)作用來(lái)還原金屬離子[7-8]。該方法具有明顯的“綠色”特征，無(wú)需添加額外的還原劑或穩(wěn)定劑，具有原料來(lái)源廣泛、反應(yīng)條件溫和、納米顆粒產(chǎn)物穩(wěn)定性高等優(yōu)勢(shì)。最早的利用植物還原法制備銀納米顆粒(AgNPs)的報(bào)道始于2003年，Gardea-Torresdey等利用紫花苜蓿制備了銀納米顆粒[9]。之后，有多種植物質(zhì)被報(bào)道用于合成銀納米顆粒[10-11]。本課題組也利用芳樟[12]、橄欖[13]、臘腸樹(shù)[14]、洋浦桃等合成出不同形貌的AgNPs。與化學(xué)法相比，將植物還原法制備的AgNPs用于抗菌織物處理時(shí)，具有更好的安全性和生物兼容性，但是目前關(guān)于此類的報(bào)道還比較少見(jiàn)[15-16]。

自然界存在本身具備抑菌活性的天然植物，如黃芩、丁香、蘆薈、黃連、大蒜、穿心蓮等，若能以此類植物質(zhì)的提取液來(lái)制備載銀抗菌織物，是否可能利用植物質(zhì)和納米銀的共同作用提高抑菌效果？基于上述，本研究選擇黃芩、丁香和兩種本身不具有抑菌活性的植物芳樟、洋浦桃分別合成AgNPs，探索該法調(diào)控粒徑的規(guī)律，繼而通過(guò)浸漬的方法將納米銀顆粒負(fù)載于純棉織物上，考察該載銀織物的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

硝酸銀、硝酸、氫氧化鈉均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Luria- Bertani（LB）肉湯和LB瓊脂培養(yǎng)基、Mueller Hinton（MH）肉湯和MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物研究所提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 植物質(zhì)提取液及銀納米顆粒的制備

植物質(zhì)提取液的制備：將采摘的洋浦桃(Syzygium samarangense，SS)、芳樟(Cinnamomum camphora，CC)樹(shù)葉以及中藥房購(gòu)買的丁香(Syzygium aromaticum，SA)、黃芩(Scutellariabaicalensi，SB) 經(jīng)干燥、粉碎獲得干粉，密閉條件下保存。準(zhǔn)確稱取3 g植物干粉放入250 ml錐形瓶中，加入100 ml去離子水，置于油浴鍋中加熱煮沸15 min，待冷卻至室溫后，抽濾得到30 g·L-1的濾液，以去離子水稀釋即得指定濃度的植物質(zhì)提取液。

銀納米顆粒的制備：將一定量的植物質(zhì)提取液和NaOH溶液混合后，置于90℃的油浴鍋中，再加入一定濃度的AgNO3溶液，磁力攪拌條件下反應(yīng)1.5 h，所得溶膠即為銀納米顆粒。

1.3 載銀織物的制備及其銀含量的測(cè)定

載銀織物的制備：將純棉織物剪為邊長(zhǎng)為1 cm的正方形，以去離子水洗滌烘干后備用。稱取一定質(zhì)量的純棉織物浸漬于10 ml濃度為1 mmol·L-1的納米銀溶膠中，在一定的溫度、浴比（織物與銀溶膠的質(zhì)量比，g·g-1）以及pH條件下對(duì)織物浸漬一段時(shí)間后取出，60℃干燥1 h即得。

載銀織物上負(fù)載銀含量的測(cè)定：將載銀織物剪碎、稱重（A），以1 ml濃硝酸溶解，再加入9 ml去離子水，抽濾得濾液。利用原子吸收分光光度計(jì)（TAS-986）測(cè)得濾液中Ag+濃度（B），則織物上負(fù)載的銀含量P（mg·kg-1）=10B/A。

1.4 銀納米顆粒及載銀織物的表征

銀納米顆粒的表征：不同條件下所得AgNPs的紫外可見(jiàn)吸收光譜（UV-Vis）在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Evolution 220，Thermo Scientific）上進(jìn)行，以去離子水作為參比；X射線粉末衍射（XRD）分析在X射線粉末衍射儀（X’Pert Pro, PANalytical）上進(jìn)行，以CuKα為輻射源，在λ=0.15418 nm，電壓40 kV，電流30 mA條件下，10°～90°范圍內(nèi)進(jìn)行掃描；透射電鏡（TEM）樣品在透射電子顯微鏡上（F30，Philips）進(jìn)行觀察，以SigmaScan Pro軟件配合Origin軟件進(jìn)行粒徑分布統(tǒng)計(jì)。

載銀織物的表征：掃描電鏡（SEM）分析和X射線能譜（EDS）在掃描電子顯微鏡（LEO1530, LEO)系統(tǒng)上進(jìn)行，由于空白織物及載銀織物本身不導(dǎo)電，需先將織物進(jìn)行噴鉑處理。

1.5 抗菌性能測(cè)試

生長(zhǎng)曲線測(cè)定[4]：以大腸桿菌為測(cè)試菌株，接種一定量的菌液至含有10 ml LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，使得菌液濃度約為2×104CFU·ml-1。加入經(jīng)過(guò)滅菌處理的空白織物或不同浸漬條件下所得載銀織物，于37℃、200 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取1 ml樣品測(cè)OD600，根據(jù)生長(zhǎng)曲線考察織物的抗菌性能。

抑菌率測(cè)定[17]：以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為測(cè)試菌株，分別接種相同量的菌液于兩個(gè)含有10 ml液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，菌液濃度約為5×103CFU·ml-1。然后分別加入空白織物（經(jīng)滅菌處理）及載銀織物，適宜條件下培養(yǎng)12 h后，涂平板查菌落數(shù)，則抑菌率= (C-A)/C。其中A為載銀織物上培養(yǎng)后的平均菌落數(shù)，C為空白織物上培養(yǎng)后的平均菌落數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀納米顆粒的合成與表征

以植物質(zhì)提取液制備AgNPs的過(guò)程中，植物質(zhì)提取液充當(dāng)還原劑和保護(hù)劑，NaOH的加入則可以提高AgNO3的還原速率[18]。圖1（a）所示為不同濃度的黃芩提取液（10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1），在250 μl 5 mol·L-1的NaOH存在的條件下，與5 mmol·L-1AgNO3在90℃中反應(yīng)1.5 h所得產(chǎn)物的UV-Vis吸收光譜圖。由圖可見(jiàn)，在400～450 nm之間均出現(xiàn)了AgNPs的SPR特征吸收峰[19]。圖2所示為20 g·L-1黃芩提取液所得的AgNPs的XRD譜 圖，圖中顯示有5個(gè)明顯的衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于面心立方結(jié)構(gòu)單質(zhì)銀的5個(gè)晶面，其峰位置與pdf卡01-087-3722上數(shù)據(jù)一致，證實(shí)了單質(zhì)AgNPs的生成。

由圖1（a）還可見(jiàn)，隨著植物質(zhì)濃度的增加，AgNPs的SPR峰出現(xiàn)了比較明顯的藍(lán)移，說(shuō)明所制得的AgNPs的平均粒徑具有變小的趨勢(shì)。圖1（b）所示為15 g·L-1的黃芩提取液與5 mmol·L-1AgNO3的混合液，分別加入不同體積（40 μl，100 μl，300 μl）5 mol·L-1的NaOH，90℃中反應(yīng)1.5 h所得到銀溶膠的UV-Vis吸收光譜圖。隨著NaOH加入量的增加，同樣觀察到AgNPs特征峰的藍(lán)移，說(shuō)明所制得的AgNPs的平均粒徑變小。

圖1 不同植物質(zhì)濃度、NaOH加入量條件下由黃芩提取液所制得的銀納米顆粒的UV-Vis吸收光譜圖 Fig.1 UV-Vis spectra of AgNPs produced bySB extract at different plant extract concentration (a) and NaOH adding amounts (b)

AgNPs的粒徑與其應(yīng)用性能密切相關(guān)，由上可知，通過(guò)改變植物質(zhì)提取液濃度或NaOH加入量可以有效調(diào)節(jié)所得AgNPs的粒徑。而且，增加植物質(zhì)提取液濃度或增大NaOH加入量，均有利于制得平均粒徑較小的AgNPs。根據(jù)上述粒徑調(diào)控規(guī)律，在硝酸銀濃度為3 mmol·L-1的條件下，通過(guò)改變黃芩提取液濃度以及所加NaOH的量制得不同粒徑的AgNPs（35，20，12，5 nm），用于后續(xù)的抗菌實(shí)驗(yàn)，具體的TEM圖片及粒徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3。值得指出的是，該粒徑調(diào)控規(guī)律對(duì)于洋浦桃、芳樟以及丁香 提取液制備AgNPs也同樣適用。

圖2 黃芩提取液制備的銀納米顆粒的XRD圖 Fig.2 X-ray diffraction patterns of AgNPs produced by SB extract

圖3 黃芩提取液制得的不同粒徑的銀納米顆粒的 TEM圖片及粒徑統(tǒng)計(jì) Fig.3 TEM images and size histogram (inset) of AgNPs with different sizes produced bySB extract

2.2 載銀織物的制備和表征

圖4 浸漬時(shí)間，浴比，溫度及pH對(duì)織物上 銀負(fù)載量的影響 Fig.4 Ag content on cotton fabric at different impregnation time (a), liquor ratio (b), temperature (c) and pH (d)

抗菌織物的制備方法主要包括纖維改性法和織物后整理法，由于前者成本較高，所以后整理法應(yīng)用比較廣泛。后整理法又包括微膠囊法、表面涂層法、浸漬法、浸軋等[20]?？紤]到浸漬法具有操作方便、不受設(shè)備條件限制等優(yōu)點(diǎn)，本研究采用浸漬法將納米銀負(fù)載于純棉織物上。實(shí)驗(yàn)將黃芩制得的粒徑為12 nm的銀溶膠與純棉織物混合，分別考察浸漬時(shí)間、浴比、溫度以及pH對(duì)純棉織物上載銀量的影響，結(jié)果如圖4所示。由時(shí)間與載銀量的關(guān) 系曲線[圖4（a）]可觀察到隨著浸漬時(shí)間的增加，織物上的載銀量逐步增加， 30 h達(dá)到平衡。載銀量與浴比的變化曲線[圖4（b）]表明，隨著浴比的減小織物上的載銀量先大幅度增加，后變化不大，為增加銀納米顆粒的利用率，確定最優(yōu)浴比為1:25。載銀量隨浸漬溫度的變化曲線[圖4（c）]顯示，隨著溫度的升高，載銀量先上升后下降，這可能是由于隨著溫度的增加，棉纖維內(nèi)部孔隙增加，有利于吸附；繼續(xù)升高溫度，孔隙過(guò)大反而不利于固載銀納米顆粒。觀察載銀量隨pH的變化曲線[圖4（d）]，雖然強(qiáng)酸條件下織物上的載銀量有所增加，但相比初始銀溶膠pH條件下（5～6）的吸附量，增加的幅度不大。且H+過(guò)多會(huì)影響織物的柔軟度，所以在浸漬工藝條件中不再調(diào)節(jié)pH。綜上，確定較優(yōu)的浸漬工藝條件為時(shí)間30 h，浴比1:25，溫度55℃。

空白織物與上述確定的較優(yōu)浸漬條件下所得的載銀織物的掃描電鏡照片見(jiàn)圖5。可以清楚地觀察到，空白織物的纖維表面光滑沒(méi)有顆粒，而載銀織物的表面則有部分顆粒（見(jiàn)圖中箭頭）。對(duì)載銀織物[圖5（b）中藍(lán)色區(qū)域]經(jīng)過(guò)EDS分析確定了Ag元素的存在，C、O元素來(lái)自織物本身，Pt元素則來(lái)自于電鏡樣品的預(yù)處理。

2.3 載銀織物的抗菌性能評(píng)價(jià)

圖5 純棉織物的SEM圖片、載銀織物的SEM圖片（圖中標(biāo)尺為2 μm）和EDS能譜分析 Fig.5 SEM image of cotton fabric (a), SEM image (b) (scale bar of 2 μm) and EDS analysis (c) of Ag coated fabric

圖6 AgNPs的粒徑對(duì)載銀織物抗菌性能和浸漬后棉織物上銀負(fù)載量的影響 Fig.6 Effect of AgNPs size on antibacterial performance of cotton fabrics (a) and Ag content on cotton fabrics (b)

2.3.1 銀納米顆粒粒徑的影響 為了考察AgNPs 粒徑對(duì)載銀織物抗菌效果的影響，將黃芩提取液所制得的4種不同粒徑的銀納米顆粒（如圖3所示）分別在最優(yōu)的浸漬條件下負(fù)載到純棉織物上。實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為測(cè)試菌種，分別測(cè)定空白織物以及載銀織物上細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線以評(píng)價(jià)織物的抗菌性能，具體結(jié)果如圖6（a）所示。由圖可見(jiàn)，粒徑越小的AgNPs所負(fù)載的織物的抗菌效果越好，這是由于粒徑較小的AgNPs，具有更大的表面積，增大了與菌種接觸的機(jī)會(huì)。為了排除該抗菌效果的差異是由于載銀量的不同所造成的，還測(cè)定了4種粒徑的AgNPs負(fù)載于織物上的銀含量[圖6（b）所示]，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)條件下AgNPs的粒徑對(duì)織物上的載銀量影響不大。AgNPs粒徑對(duì)載銀織物抗菌效果的影響規(guī)律同樣適用于其他3種植物質(zhì)提取液。

圖7 洋浦桃、芳樟、黃芩、丁香提取液所得AgNPs的 TEM圖片及粒徑統(tǒng)計(jì) Fig.7 TEM images and size histogram (inlet) of AgNPs produced by SS (a),CC (b), SB (c) and SA(d) extracts

圖8 4種植物質(zhì)提取液所得載銀織物的抗菌性能和 銀的負(fù)載量 Fig.8 Antibacterial performance (a) and Ag content (b) of coated fabric prepared from four plants

2.3.2 植物質(zhì)種類的影響 運(yùn)用前述的粒徑調(diào)節(jié)規(guī)律，以4種植物質(zhì)提取液分別合成出了平均粒徑為6 nm左右的AgNPs （如圖7所示）。再將其分別負(fù)載于織物上，所得載銀織物的抗菌性能如圖8（a）所示?？梢钥闯?種植物質(zhì)中，以黃芩提取液制得 的載銀織物抗菌性能最優(yōu)，洋浦桃提取液所得的抗菌性能最差。圖8（b）給出了這4種載銀織物上負(fù)載的Ag含量，可以看出差異性非常明顯，這可能與4種植物質(zhì)提取液的黏度和組成的不同相關(guān)。盡管丁香本身的抗菌性優(yōu)于黃芩，但是由于載銀量偏低，導(dǎo)致所得織物的抑菌性不突出。值得注意的是：黃芩所得載銀織物上的銀含量低于芳樟所得載銀織物，但是抑菌效果仍然優(yōu)于后者，而兩者所負(fù)載的AgNPs粒徑相當(dāng)，說(shuō)明利用本身具有抑菌效果的黃芩來(lái)制備AgNPs，有利于增強(qiáng)所得載銀織物的整體抗菌性能。同樣，對(duì)比丁香與洋浦桃提取液所得載銀織物，二者載銀量相近，而抑菌效果前者明顯優(yōu)于后者。這一結(jié)果對(duì)于開(kāi)發(fā)具有協(xié)同抗菌作用的功能性織物具有啟示意義。

2.3.3 黃芩制得的載銀織物對(duì)不同菌株的抑菌率 以具有最好抑菌效果的黃芩載銀織物為研究對(duì)象，考察其抗菌廣譜性。實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為測(cè)試菌株，在菌液濃度約為5×103CFU·ml-1的情況下，測(cè)得的抑菌率結(jié)果列于表1。由表可見(jiàn)該載銀純棉織物對(duì)4種測(cè)試菌種的抑菌率均達(dá)到了99%以上，具有良好的應(yīng)用前景。

表1 黃芩所得載銀棉織物的抗菌效果 Table 1 Antibacterial rate of Ag coated fabric made from SB against different bacterium

3 結(jié) 論

本文利用植物還原法綠色合成制備得到不同粒徑的AgNPs，并將其負(fù)載于純棉織物上，評(píng)價(jià)所得載銀織物的抗菌性能。所選擇的黃芩、丁香、洋浦桃、芳樟4種植物質(zhì)提取液均可以制備AgNPs，UV-Vis、TEM等表征技術(shù)表明增加植物質(zhì)提取液濃度或NaOH加入量，有利于制得粒徑較小的AgNPs。SEM圖片表明通過(guò)浸漬可將所得AgNPs負(fù)載于純棉織物上，確定的較優(yōu)的浸漬工藝條件為時(shí)間30 h，溫度55℃，浴比為1:25。對(duì)于同一種植物質(zhì)所制備的載銀織物，負(fù)載于織物上的AgNPs粒徑越小，抑菌效果越好。本身具有抑菌作用的藥用植物丁香、黃芩與制得的AgNPs在織物上起到了共同抗菌的作用。負(fù)載相同粒徑AgNPs時(shí)，4種植物質(zhì)中以黃芩制得的載銀織物抗菌效果最優(yōu)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展和人類對(duì)健康追求的不斷提高，納米銀抗菌織物必將日益受到人們的重視，并運(yùn)用到更多領(lǐng)域。

[1] Czajka R.Development of medical textile market [J].Fibres & Textiles in Eastern Europe,2005, 13 (1): 13-15.

[2] Goren?ek M, Recelj P.Nanosilver functionalized cotton fabric [J].Textile Research Journal,2007, 77 (3): 138-141.

[3] Gao Y, Cranston R.Recent advances in antimicrobial treatments of textiles [J].Textile Research Journal,2008, 78 (1): 60-72.

[4] Lee H Y, Park H K, Lee Y M, Kim K, Park S B.A practical procedure for producing silver nanocoated fabric and its antibacterial evaluation for biomedical applications [J].Chemical Communication,2007, (28): 2959-2961.

[5] Chernousova S, Epple M.Silver as antibacterial agent: Ion, nanoparticle, and metal [J].Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52 (6): 1636–1653.

[6] Chen Y H, Hsu C C, He J L.Antibacterial silver coating on poly(ethylene terephthalate) fabric by using high power impulse magnetron sputtering [J].Surface and Coatings Technology,2013, 232: 868-875.

[7] Iravani S.Green synthesis of metal nanoparticles using plants [J].Green Chemistry,2011, 13 (10): 2638-2650.

[8] Mittal A K, Chisti Y, Banerjee U C.Synthesis of metallic nanoparticles using plant extracts [J].Biotechnology Advances,2013, 31 (2): 346-356.

[9] Gardea-Torresdey J L, Gomez E, Peralta V R, Parsons J G, Troiani H, Jose Y M.Alfalfa sprouts: a natural source for the synthesis of silver nanoparticles [J].Langmuir,2003, 19 (4): 1357-1361.

[10] Zhang Y Q, Cheng X F, Zhang Y C, Xue X H, Fu Y Z.Biosynthesis of silver nanoparticles at room temperature using aqueous aloe leaf extract and antibacterial properties [J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2013, 423: 63-68.

[11] Khalil M M H, Ismail E H, El-Baghdady K Z, Mohamed D.Green synthesis of silver nanoparticles using olive leaf extract and its antibacterial activity [J].Arabian Journal of Chemistry,2014, 7 (6): 1131-1139.

[12] Huang J L, Li Q B, Sun D H, Lu Y H, Su Y B, Yang X, Wang H X, Wang Y P, Shao W Y, He N.Biosynthesis of silver and gold nanoparticles by novel sundried Cinnamomum camphora leaf [J].Nanotechnology,2007, 18 (10): 105104.

[13] Wu L F, Wu W W, Jing X L, Huang J L, Sun D H, Odoom-Wubah T, Liu H Y, Wang H T, Li Q B.Trisodium citrate-assisted biosynthesis of silver nanoflowers by Canarium album foliarbroths as a platform for SERS detection [J].Industrial & Engineering Chemistry Research,2013, 52 (14): 5085-5094.

[14] Lin L Q, Wang W T, Huang J L, Li Q B, Sun D H, Yang X, Wang H X, He N, Wang Y P.Nature factory of silver nanowires: plant-mediated synthesis using broth of Cassia fistulaleaf [J].Chemical Engineering Journal,2010, 162 (2): 852-858.

[15] Ravindra S, Murali M Y, Narayana R N, Mohana R K.Fabrication of antibacterial cotton fibres loaded with silver nanoparticles via“Green Approach” [J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2010, 367 (1-3): 31-40.

[16] Schr?fel A, Krato?ová G, ?afa?ík I, ?afa?íková M, Ra?ka I, Shor L M.Applications of biosynthesized metallic nanoparticles—A review [J].Acta Biomaterialia,2014, 10 (10): 4023-4042.

[17] Durán N, Marcato P D, De S G I H, Alves O L, Esposito E.Antibacterial effect of silver nanoparticles produced by fungal process on textile fabrics and their effluent treatment [J].Journal of Biomedical Nanotechnology,2007, 3 (2): 203-208.

[18] Fu M X, Li Q B, Sun D H, Lu Y H, He N.Rapid preparation process of silver nanoparticles by bioreduction and their characterizations [J].Chinese Journal of Chemical Engineering,2006, 14 (1): 114-117.

[19] Ahmad A, Mukherjee P, Senapati S, Mandal D, Khan M I, Kumar R, Sastry M.Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungusFusarium oxysporum[J].Colloids and surfaces B:Biointerfaces,2003, 28 (4): 313-318.

[20] Zhang Ziyi (張子誼), Gao Xiaohong (高曉紅), Jia Xueping (賈雪平).The application of nano-silver in textile industry [J].China Textile Leader,2013, (5): 78-80.