甄珍，蔣少云，陶玉飛，嚴(yán)志敏，鄧嘉胤

堿性成纖維細胞生長因子對人牙齦成纖維細胞成骨分化與增殖的影響

甄珍，蔣少云，陶玉飛，嚴(yán)志敏，鄧嘉胤△

目的 觀察堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞（HGFs）成骨分化能力與細胞增殖的影響，探索bFGF在HGFs體外誘導(dǎo)成骨分化過程中的作用。方法 采用組織塊貼壁法體外培養(yǎng)HGFs，取第3代細胞進行如下分組培養(yǎng)。1組為普通培養(yǎng)基組，2組為普通培養(yǎng)基+10 μg/L bFGF組，3組為成骨誘導(dǎo)組，4組為成骨誘導(dǎo)+10 μg/L bFGF組。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍比色法檢測HGFs增殖狀況；用堿性磷酸酶染色法及茜素紅染色法檢測HGFs的成骨分化能力。結(jié)果 在普通培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，10 μg/L的bFGF均能促進HGFs的增殖（P＜0.01）；在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中HGFs具有骨向分化能力，形成鈣結(jié)節(jié)；而10 μg/L的bFGF對HGFs的堿性磷酸酶活性與礦化結(jié)節(jié)形成能力均無明顯影響。結(jié)論 10 μg/L的bFGF能促進HGFs的增殖能力，而對其骨向分化無明顯影響。

成纖維細胞生長因子2；成纖維細胞；牙齦；骨生成；細胞分化；細胞增殖

牙周炎作為一種炎癥破壞性疾病，不僅表現(xiàn)為牙齦的炎癥，而且會引起牙周膜、牙槽骨等牙周支持性組織的破壞吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動脫落。如何獲得牙周再生是近年來研究的熱點。作為牙周組織工程中種子細胞的牙周膜韌帶細胞，因為其有限的來源而限制了它的應(yīng)用。口腔牙齦組織來源豐富，人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）可以在體外誘導(dǎo)礦化［1］，這為牙周再生中種子細胞的來源提供了一種潛在的可能性。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一種可促進細胞有絲分裂的多肽生長因子，同時還具有促進血管形成的作用［2］，常被局部應(yīng)用促進創(chuàng)傷的愈合。本實驗旨在觀察bFGF對HGFs成骨分化能力與細胞增殖的影響，探索bFGF在HGFs體外誘導(dǎo)成骨分化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 L-DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國），bFGF（Invitrogen，美國），地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅（Sigma，美國），L-谷氨酰胺（Sigma，北京），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Solarbio，北京），5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP/nitroblue tetrazolium，NBT）堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（華興博創(chuàng)，北京），氯代十六烷基吡啶（光復(fù)精細化工研究所，天津）。

1.2 方法

1.2.1 HGFs體外分離與培養(yǎng) 取就診于天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科年輕志愿者因阻生智齒（無齲病或牙周?。┌纬g(shù)中分離的少量新鮮健康牙齦組織，用含100 U雙抗的PBS液充分沖洗，去除表面的血凝塊及可能殘留的口腔微生物，常規(guī)組織塊法進行原代培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下嚴(yán)密觀察細胞生長狀況，待長滿瓶底70%～80%時用0.25%胰酶按1∶2傳代，取第3代細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 1組：普通培養(yǎng)基組（L-DMEM和3% FBS）；2組：普通培養(yǎng)基+10 μg/L bFGF組；3組：成骨誘導(dǎo)組（L-DMEM、3%FBS、1×10-7mol/L地塞米松、2×10-3mol/L L-谷氨酰胺、1×10-3mol/L β-甘油磷酸鈉和5 mg/L抗壞血酸）；4組：成骨誘導(dǎo)+10 μg/L bFGF組。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖 取第3代HGFs以3×103/孔密度接種于96孔板中，每孔液量100 μL。貼壁后更換上述分組培養(yǎng)基，每個處理組設(shè)置5個復(fù)孔，每孔100 μL；調(diào)零孔不接種細胞，僅加入相應(yīng)組別的培養(yǎng)基100 μL。將96孔板放入37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第1、3、5、7、9、11天的同一時刻，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩15 min使結(jié)晶物充分溶解，選取490 nm波長在紫外分光光度儀上測各孔吸光度（A）值。

1.2.4 堿性磷酸酶（ALP）染色 取第3代HGFs以2×104/孔密度接種于6孔板中。貼壁后更換分組培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每3 d換液1次，培養(yǎng)至第7天，棄培養(yǎng)基后使用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min后再次用PBS洗滌3次，每次5～10 min。使用ALP活性染色試劑盒避光染色15～30 min，在顯色對比最明顯時棄染色劑終止反應(yīng)，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 茜素紅染色及半定量檢測 取第3代HGFs以2× 104/孔密度接種于6孔板中。貼壁后更換分組培養(yǎng)基，每3 d換液1次，第21天終止培養(yǎng)后，4%多聚甲醛固定30 min后進行0.5%茜素紅（pH=8.8）室溫染色1 h，并在倒置顯微鏡下觀察、拍照。后棄去上清，PBS洗3遍后加入100 mmol/L氯代十六烷基吡啶室溫孵育1 h，紫外分光光度儀測562 nm波長處樣本的A值，用氯代十六烷基溶液調(diào)零，并同時測定一組未加茜素紅的單純細胞上清A值，每個樣本重復(fù)3次。樣本測定A值=樣本A值-單純細胞組A值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SAS V8統(tǒng)計分析軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，MTT結(jié)果采用兩獨立樣本t檢驗，其余多組間比較采用方差分析，多重比較采用SNK-q法。檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HGFs原代培養(yǎng) 在組織塊貼壁后3～7 d有單個細胞從組織塊中爬出，絕大多數(shù)呈飽滿的長梭形，并呈放射狀排列，隨培養(yǎng)時間的延長細胞數(shù)目增多而向外移行，見圖1。傳代后細胞呈長梭形，生長迅速，排列密集后呈漩渦狀，方向性明顯，見圖2。

Fig.1 Primary culture of HGFs（×100）圖1 原代培養(yǎng)的HGFs（×100）

Fig.2 First passage of HGFs（×100）圖2 第1代HGFs（×100）

2.2 bFGF對成骨誘導(dǎo)分化中HGFs增殖的影響 在培養(yǎng)第3天起，增殖情況出現(xiàn)明顯差別（P＜0.01）。無論在普通培養(yǎng)基中還是在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，bFGF均促進HGFs的細胞增殖，在第7天時達到最強，見表1。

Tab.1 Effect of bFGF on HGFs proliferation during osteogenic differentiation表1 bFGF對成骨誘導(dǎo)分化中HGFs增殖的影響（n=5，±s）

Tab.1 Effect of bFGF on HGFs proliferation during osteogenic differentiation表1 bFGF對成骨誘導(dǎo)分化中HGFs增殖的影響（n=5，±s）

＊＊P＜0.01

組別1組2組t 3組4組t 第1天0.29±0.02 0.30±0.04 0.368 0.28±0.02 0.29±0.05 0.225 第3天0.41±0.03 0.53±0.01 9.461＊＊0.38±0.03 0.47±0.01 6.938＊＊第5天0.50±0.03 0.60±0.03 5.802＊＊0.43±0.01 0.52±0.01 28.947＊＊第7天0.67±0.03 1.07±0.04 17.551＊＊0.61±0.01 0.75±0.01 35.980＊＊第9天0.49±0.04 1.02±0.02 25.123＊＊0.45±0.01 0.63±0.01 28.653＊＊第11天0.41±0.04 0.82±0.04 17.693＊＊0.37±0.03 0.52±0.03 8.844＊＊

2.3 bFGF對成骨誘導(dǎo)分化中HGFs ALP活性的影響 普通培養(yǎng)基（1組、2組）不論是否添加bFGF，均無明顯著色區(qū)；單純成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（3組）與添加bFGF（4組）后ALP顯色明顯，但大體觀無明顯差別，見圖3。光鏡下，普通培養(yǎng)基（1組、2組）中的HGFs均無細胞著色，而成骨誘導(dǎo)組（3組）與成骨誘導(dǎo)+bFGF組（4組）均有大量細胞被染為藍紫色，見圖4。

2.4 bFGF對成骨誘導(dǎo)分化中HGFs礦化結(jié)節(jié)能力的影響 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，成骨誘導(dǎo)組（3組）與添加bFGF組（4組）均可見明顯的鈣結(jié)節(jié)形成；而普通培養(yǎng)基（1組）及添加bFGF組（2組）均無肉眼可見的鈣結(jié)節(jié)著色區(qū)，見圖5。鏡下可見成骨誘導(dǎo)組（3組）與成骨誘導(dǎo)+bFGF組（4組）均有大量紅色鈣結(jié)節(jié)形成，普通培養(yǎng)基組（1組）與添加bFGF的普通培養(yǎng)基組（2組）中只有長梭形的成纖維細胞背景而無著色的鈣結(jié)節(jié)，見圖6。1～4組的A值分別為 0.032±0.002、0.043±0.002、0.217±0.007和0.207±0.010，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=805.67，P＜0.01）。成骨誘導(dǎo)組（3組）與成骨誘導(dǎo)+bFGF組（4組）的A值高于普通培養(yǎng)基組（1組）與普通培養(yǎng)基+ bFGF組（2組）；而成骨誘導(dǎo)組（3組）與成骨誘導(dǎo)+ bFGF組（4組）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

成纖維細胞是結(jié)締組織中含量最為豐富的細胞類型，HGFs除了具有一般的成纖維細胞特性外，還表現(xiàn)出更高的再生潛能，并且能夠起到抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用［3］。bFGF是一種廣譜的有絲分裂原，能促進來源于中胚層和神經(jīng)外胚層多種細胞的增殖能力［4］。本實驗中，無論在普通培養(yǎng)基還是成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，bFGF均能促進HGFs的增殖能力。bFGF這種明顯促進細胞增殖的能力加之其具有的促血管生成能力，被廣泛應(yīng)用于軟組織創(chuàng)傷的愈合與再生［5-6］。

堿性磷酸酶是廣泛存在于人體骨骼、胎盤等經(jīng)肝臟向膽外排出的一種同源二聚體蛋白。本實驗所采用的BCIP/NBT是堿性磷酸酯酶的常見底物，在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP會被水解產(chǎn)生強反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會和NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的藍紫色NBT斑，一般用于未分化的干細胞或細胞成骨向分化的檢測。從實驗結(jié)果可看出成骨誘導(dǎo)組與成骨誘導(dǎo)+bFGF組HGFs均表現(xiàn)出明顯的ALP著色。既往研究中，不同實驗者對bFGF與細胞ALP活性間的研究結(jié)果不同，究其原因可能為FGFs家族中不同F(xiàn)GF亞類間的結(jié)構(gòu)和功能的差異，實驗細胞種類及實驗所選細胞株及其所處生命周期不同，或者所用bFGF含量不同等因素引起?，F(xiàn)有研究表明，HGFs在基線水平即有成骨相關(guān)基因的表達［7］，同時相比于牙周膜細胞中Ⅰ型與Ⅲ型膠原強陽性的表達而言，雖然HGFs這兩種膠原的表達能力較弱，但它仍具有牙周膜細胞的一些特性，這都為本實驗中HGFs在體外誘導(dǎo)礦化條件下能夠增強向成骨細胞分化的趨勢提供了一定的理論依據(jù)。

成骨細胞在成熟過程中主要經(jīng)歷細胞增殖、基質(zhì)成熟及礦化形成三個階段［8］。堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原等主要在成骨分化的早期表達［9］，而后期細胞與基質(zhì)的礦化過程中必然有骨鈣素的參與。本研究結(jié)果顯示，在加入bFGF的普通培養(yǎng)基中并未見到礦化結(jié)節(jié)的形成，說明單純的bFGF并不具有異位成骨的功能。本實驗中，單純成骨誘導(dǎo)組與加入了bFGF的成骨誘導(dǎo)組兩者之間鈣結(jié)節(jié)的半定量測定結(jié)果差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，說明10 μg/L的bFGF對人牙齦成纖維細胞的成骨分化無明顯作用。

Maegawa等［10］研究發(fā)現(xiàn)在bFGF后序列性使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）可以明顯提高骨髓間充質(zhì)干細胞骨鈣素的表達與骨基質(zhì)的分泌；Qu等［11］將骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染bFGF后，與納米羥基磷灰石/聚酰胺66復(fù)合材料聯(lián)用，可以模擬骨缺損部位的骨再生過程；Saito等［12］將bFGF與不同復(fù)合材料聯(lián)合使用于根分叉病變的治療中，明顯提高了牙周結(jié)締組織的附著能力、增加了牙周膜韌帶與牙骨質(zhì)的形成、牙槽骨的沉積；Oortqiesen等［13］在實驗性大鼠牙周組織骨內(nèi)缺損模型中，使用bFGF與磷酸鹽接合劑顯著提高了牙周膜韌帶以及牙槽骨組織的愈合能力。雖然本實驗表明10 μg/L的bFGF對HGFs在成骨分化過程中無影響，但是如果將bFGF與其他生長因子時序性作用于HGFs，再聯(lián)合其他生物支架材料，一方面提高HGFs骨向分化的能力，另一方面利用bFGF自身促進細胞增殖、促進血管生成、與生物材料結(jié)合后促進軟組織再生的能力，或許可以實現(xiàn)更易得的牙周再生。

（圖3～6見插頁）

［1］Chen S，Lyu LX，Huang NP，et al.Inducing the differentiation of hu?man gingival fibroblasts into osteoblasts in vitro［J］.J Med Postgra，2013，26（9）:925-927.［陳嵩，呂蘭欣，黃寧平，等.人牙齦成纖維細胞體外誘導(dǎo)成骨分化的實驗研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26（9）:925-927］.doi:10.3969/j.issn.1008-8199.2013.09.007.

［2］Matsumoto S，Tanaka R，Okada K，et al.The effect of control-re?leased basic fibroblast growth factor in wound healing:histological analyses and clinical application［J］.Plast Reconstr Surg Glob Open，2013，1（6）:e44.doi:10.1097/GOX.0b013e3182a88787.

［3］Zhang QZ，Nquyen AL，Yu WH，et al.Human oral mucosa and gin?giva:a unique reservoir for mesenchymal stem cells［J］.J Dent Res，2012，91（11）:1011-1018.doi:10.1177/0022034512461016.

［4］Bhang SH，Sun AY，Yang HS，et al.Skin regeneration with fibroblast growth factor 2 released from heparin-conjugated fibrin［J］.Biotech?nol Lett，2011，33（4）:845-851.doi:10.1007/s10529-010-0492-5.

［5］Kinoshita N，Tsuda M，Hamuy R，et al.The usefulness of basic fi? broblast growth factor for radiation-exposed tissue［J］.Wound Re?pair Regen，2012，20（1）:91- 102.doi: 10.1111/j.1524-475X.2011.00758.x.

［6］Mutsuzaki H，Ito A，Sogo Y，et al.Enhanced wound healing associat?ed with Sharpey's fiber-like tissue formation around FGF-2-apa?tite composite layers on percutaneous titanium screws in rabbits［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2012，132（1）:113-121.doi:10.1007/ s00402-011-1381-7.

［7］Zhou Y，Hutmacher DW，Sae-Lim V，et al.Osteogenetic and adipo?genic induction potential of human periodontal cells［J］.J Periodon?tol，2008，79（3）:525-534.doi:10.1902/jop.2008.070373.

［8］Cotter EJ，Ip HS，Powderly WG，et al.Mechanism of HIV protein in?duced modulation of mesenchymal stem cell osteogenic differentia?tion［J］.BMC Musculoskelet Disord，2008，13（9）:33.doi:10.1186/ 1471-2474-9-33.

［9］Du JJ，Luo ZJ，Hu YY，et al.Expression of collagen I、II and alka?line phosphatase in osteogenesis induced by rhBMP-2 enhanced by bFGF［J］.Orthop J Chin，2002，9（1）:39-42.［杜俊杰，羅卓荊，胡蘊玉，等.bFGF增強rhBMP-2誘導(dǎo)成骨中Ⅰ、Ⅱ型膠原及堿性磷酸酶的表達［J］.中國矯形外科雜志，2002，9（1）:39-42］.

［10］Maegawa N，Kawamura K，Hirose M，et al.Enhancement of osteo?blastic differentiation of mesenchymal stromal cells cultured by se?lective combination of bone morphogenetic protein-2（BMP-2）and fibroblast growth factor-2（FGF-2）［J］.J Tissue Eng Regen Med，2007，1（4）:306-313.doi:10.1002/term.41.

［11］Qu D，Li J，Li Y，et al.Angiogenesis and osteogenesis enhanced by bFGF ex vivo gene therapy for bong tissue engineering in recon?struction of calvarial defects［J］.J Biomed Mater Res A，2011，96（3）: 543-515.doi:10.1002/jbm.a.33009.

［12］Saito A，Saito E，Kuboki Y，et al.Periodontal regeneration following application of basic fibroblast growth factor-2 in combination with beta tricalcium phosphate in class III furcation defects in dogs［J］.Den Mater J，2013，32（2）:256-262.doi:10.4012/dmj.2012-171.

［13］Oortqiesen DA，Walboomers XF，Bronckers AL，et al.Periodontal regeneration using an injectable bone cement combined with BMP-2 or FGF-2［J］.J Tissue Eng Regen Med，2014，8（3）:202-209.doi: 10.1002/term.1514.

（2014-07-31收稿 2014-12-12修回）

（本文編輯 魏杰）

Effect of basic fibroblast growth factor on osteogenic differentiation and cell proliferation of human gingival fibroblasts in vitro

ZHEN Zhen，JIANG Shaoyun，TAO Yufei，YAN Zhimin，DENG Jiayin△
Department of Periodontology，Stomatology Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：yazhou2991@126.com

Objective To observe the effects of basic fibroblast growth factor（bFGF）on osteogenic differentiation abili?ty and cell proliferation of human gingival fibroblasts（HGFs），and to explore the role of bFGF on the process of osteogenicdifferencitiaion in vitro.Methods HGFs were cultured in vitro until the 3rd passage when they were divided into four groups:normal medium as group 1，normal medium with 10 μg/L bFGF as group 2，osteogenic medium as group 3 and osteo?genic medium with 10 μg/L bFGF as group 4.MTT assay was used to evaluate the proliferation of HGFs.Alkaline phospha?tase（ALP）staining and Alizarin red staining were applied to investigate osteogenic potential of HGFs under different culture conditions.Results bFGF at concentration of 10 μg/L could increase HGFs proliferation in both normal and osteogenic medium（P＜0.01）.HGFs could be induced towards osteogenic differentiation and form mineralized nodule in osteogenic me?dium.However，10 μg/L bFGF had no effects on ALP activity and mineralized nodule formation of HGFs during osteogenic differentiation.Conclusion bFGF could promote the proliferation of HGFs but show no effects on osteogenic differentiation of HGFs at concentration of 10 μg/L.

fibroblast growth factor 2；fibroblasts；gingiva；osteogenesis；cell differentiation；cell proliferation

R781.4+2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.003

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃（自然科學(xué)基金重點項目）（12JCZDJC22700）

天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院（郵編300070）

作者信息：甄珍（1989），女，碩士研究生在讀，主要從事牙周組織工程的研究。

△E-mail:yazhou2991@126.com