崔丹，趙杰，劉朋沖，馮秀莉，李志惠

胸腔積液與外周血ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的效果比較

崔丹，趙杰，劉朋沖，馮秀莉，李志惠△

目的 通過比較不同途徑的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）檢測(cè)，探討其對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值。方法采用T-Spot-TB試劑盒對(duì)164例結(jié)核性胸腔積液和102例非結(jié)核性胸腔積液患者的外周血和胸腔積液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。比較兩組的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)（SFC），采用診斷試驗(yàn)比較胸腔積液與外周血ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度及特異度。結(jié)果 胸腔積液與外周血ELISPOT檢測(cè)的受試者工作特征曲線下面積分別為0.947和0.905；胸腔積液ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度（95.1%）高于外周血（89.0%）；特異度（90.2%）也高于外周血（88.2%）。結(jié)論 胸腔積液較外周血ELISPOT檢測(cè)具有更高的診斷結(jié)核性胸膜炎的價(jià)值。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)；斑點(diǎn)形成細(xì)胞；胸腔積液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞；外周血單個(gè)核細(xì)胞

胸腔積液是胸膜疾病的常見臨床表現(xiàn)，其中結(jié)核性胸腔積液占胸腔積液病因的半數(shù)以上［1］。由于胸腔積液涂片抗酸染色陽性率及結(jié)核菌培養(yǎng)陽性率極低［2］，胸膜活檢為有創(chuàng)性檢查，故結(jié)核性胸膜炎的診斷與鑒別診斷一直是臨床難題，迫切需要良好的免疫學(xué)診斷指標(biāo)提高工作效率。近年來，基于外周血淋巴細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)（enzyme-linked immunospotassay，ELISPOT）用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷較快速且敏感［3］；對(duì)于診斷菌陰性肺結(jié)核及肺外結(jié)核也有重要的參考價(jià)值。由于結(jié)核感染部位具有隔室化效應(yīng)，即大量淋巴細(xì)胞募集到感染部位，進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)［4］，故結(jié)核性胸膜炎胸腔積液中的局部細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)高于外周血，胸腔積液ELISPOT檢測(cè)有可能獲得比外周血更高的診斷價(jià)值，但目前尚無確定的診斷界值。本研究通過對(duì)164例結(jié)核性胸腔積液和102例惡性胸腔積液者同時(shí)行外周血和胸腔積液的ELISPOT檢測(cè)，探討ELISPOT診斷結(jié)核性胸膜炎的臨床價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年1月—2015年1月入住我科的初次診斷為結(jié)核性胸膜炎的患者164例（結(jié)核組），其中男79例，女85例，年齡18～63歲，平均（39±18）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床有結(jié)核中毒癥狀（如發(fā)熱、乏力、消瘦等）。（2）胸腔積液為滲出液，腺苷脫氨酶增高。（3）胸部影像學(xué)可見結(jié)核灶或無結(jié)核灶。（4）胸水、痰檢涂片或結(jié)核菌培養(yǎng)陽性。（5）結(jié)核菌素（PPD）試驗(yàn)陽性。（6）經(jīng)穿刺規(guī)律抗結(jié)核治療2個(gè)月內(nèi)，臨床癥狀消失、胸水吸收。（7）治療觀察1年無復(fù)發(fā)。選取非結(jié)核性胸膜炎患者102例（對(duì)照組），其中男58例，女44例，年齡25～65歲，平均年齡（41±16）歲；包括肺癌胸膜轉(zhuǎn)移89例，胸膜間皮瘤3例，淋巴瘤2例，肺炎旁積液8例。2組均人免疫缺陷病毒陰性，無合并糖尿病，無風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病，無嚴(yán)重心、肝、腎功能不全。2組年齡（t=1.75）、性別構(gòu)成（χ2=1.89）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 ELISPOT檢測(cè)方法 分別采集2組的胸腔積液及外周血，采用英國(guó)Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-Spot-TB試劑盒進(jìn)行檢測(cè)：胸腔積液分離得到胸腔積液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞（PEMC），外周血分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），并制備成濃度為2.0×106/mL的細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，植物血凝素（PHA）為陽性對(duì)照，結(jié)核菌特異度抗原ESAT-6和CFP-10為刺激抗原。每孔加入含2.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將微孔板放在含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h，第2天洗板后加入生物素標(biāo)記的二抗，2～8℃反應(yīng)1 h，洗板后加入顯色底物液，室溫靜置7 min，去離子水終止反應(yīng)。通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)系統(tǒng)自動(dòng)分析儀（美國(guó)CTL公司）記錄斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)（SFC）。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)SFC＜6時(shí)，任一實(shí)驗(yàn)孔SFC減去空白孔SFC≥6，結(jié)果為陽性；若空白對(duì)照孔SFC≥6，任一實(shí)驗(yàn)孔SFC≥2倍空白孔SFC，結(jié)果為陽性；否則為陰性。如果不符合上述標(biāo)準(zhǔn)且陽性對(duì)照孔正常時(shí)，結(jié)果為無反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，2組間SFC比較采用Mann Whitney U檢驗(yàn)，繪制受試者工作特性曲線（ROC曲線），判定ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的準(zhǔn)確性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

結(jié)核組胸腔積液SFC的中位數(shù)為279個(gè)/ 106PEMC，高于外周血的44個(gè)/106PBMC（U=376.0，P＜0.05）。胸腔積液ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸腔積液的界值為103 SFCs/106PEMC，外周血?jiǎng)t為10 SFCs/106PEMC，見圖1。胸腔積液ELISPOT檢測(cè)對(duì)于結(jié)核性胸腔積液診斷的靈敏度和特異度均較好，診斷效能高于外周血，見表1。

3 討論

結(jié)核菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫以Th1型細(xì)胞免疫為主，結(jié)核菌抗原特異度干擾素（IFN）-γ是其分泌的主要細(xì)胞因子。ELISPOT檢測(cè)是通過檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞來判斷目前受試者是否感染結(jié)核桿菌的新方法。傳統(tǒng)對(duì)結(jié)核病的診斷主要依據(jù)細(xì)菌學(xué)檢查與PPD試驗(yàn)，由于結(jié)核分枝桿菌（mycobacrterium tuberculosis，MTB）本身生長(zhǎng)特點(diǎn)以及卡介苗（bacillus calmette-guerin，BCG）接種在我國(guó)的廣泛使用，使得這些方法對(duì)結(jié)核病診斷極為有限。而ELISPOT檢測(cè)不受卡介苗接種及機(jī)體免疫狀態(tài)的影響，可有效篩查結(jié)核感染［5］。該技術(shù)已經(jīng)成為一種新的判斷結(jié)核分枝桿菌感染的快速輔助方法［6］。Pai等［7］研究表明，ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核的靈敏度和特異度均為93%。

Fig.1 The ROC curve of ELISPOT test using pleural effusion or peripheral blood圖1 胸腔積液與外周血ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的ROC曲線

Tab.1 The index of pleural effusion or peripheral blood ELISPOT tests in diagnosing tuberculous pleurisy表1 胸腔積液與外周血ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的指標(biāo)

雖然越來越多的報(bào)道證實(shí)ELISPOT檢測(cè)在結(jié)核感染診斷中的重要價(jià)值，但也有學(xué)者提出ELISPOT檢測(cè)不能區(qū)分結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核，致使其診斷的特異度不高［8］。由于結(jié)核感染具有隔室化效應(yīng)，胸腔積液的ELISPOT檢測(cè)較外周血ELISPOT檢測(cè)受結(jié)核潛伏感染影響較小，可更為準(zhǔn)確地診斷結(jié)核性胸膜炎。本研究根據(jù)結(jié)核組和對(duì)照組的斑點(diǎn)數(shù)建立ROC曲線，胸腔積液和外周血ELISPOT檢測(cè)曲線下面積分別為0.947和0.905，提示兩種檢測(cè)均可作為診斷結(jié)核性胸膜炎的有效指標(biāo)。胸腔積液ELISPOT檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為95.1%，特異度為90.2%，分別高于外周血的89.0%和88.2%。提示胸腔積液ELISPOT檢測(cè)在結(jié)核性胸膜炎的診斷與鑒別診斷中有更高的參考價(jià)值。

國(guó)外有報(bào)道顯示利用ELISPOT檢測(cè)結(jié)核性胸腔積液中SFC大約是外周血SFC的15倍［9］。國(guó)內(nèi)也有報(bào)道表明，胸腔、腹腔積液檢測(cè)SFC分別是外周血的 6.4和 31.9倍［10］。本研究中胸腔積液ELISPOT檢測(cè)SFC的中位數(shù)279個(gè)/106PEMC，高于外周血的44個(gè)/106PBMC，是外周血的6.3倍，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相符。證實(shí)胸腔積液中結(jié)核菌特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)要明顯高于外周血，提示胸腔積液ELISPOT檢測(cè)是診斷結(jié)核性胸膜炎的快速敏感的方法。

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（2015-03-17收稿 2015-04-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Comparison of effects of ELISPOTs using pleural fluid and peripheral blood in the diagnosis of tuberculous pleurisy

CUI Dan，ZHAO Jie，LIU Pengchong，F(xiàn)ENG Xiuli，LI Zhihui△
Department of tuberculosis，Hebei Chest Hospital，He Bei Province，Shijiazhuang 050041，China
△Corresponding Author E-mail:shuiqing_2001@sina.com

Objective To evaluate the effects of ELISPOT（enzyme-link immunospot）test using different samples in diagnosing tuberculous pleurisy.Methods Using T-Spot-TB kit to detect interferon-γ level in pleural effusion and peripheral blood from 164 patients with tuberculous pleural effusion and 102 patients without tuberculous pleural effusion.Number of spot forming cells（SFCs）as well as the specificity and sensitivity of the tests were compared between these two methods （ELISPOT using leural effusion or peripheral blood）.Results The area under the ROC curve was 0.947 in pleural effusion Elispot test while it was 0.905 in peripheral blood Elispot test.The sensitivity of pleural effusion ELISPOT test in diagnosis of tuberculous pleurisy（95.1%）was significantly higher than that of peripheral blood ELISPOT test（89.0%）.What’s more，the specificity of pleural effusion ELISPOT test in diagnosis of tuberculous pleurisy（90.2%）was higher than that in diagnosis of peripheral blood ELISPOT test（88.2%）.Conclusion The pleural effusion ELISPOT test is more valuable than peripheral blood ELISPOT in the diagnosis of tuberculous pleuritis.

enzyme-linked immunospot assay；spot forming cells；pleural effusion mononuclear cells；peripheral blood mononuclear cells

R561.1

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.028

河北省胸科醫(yī)院結(jié)核一科（郵編050041）

崔丹（1982），女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸、結(jié)核疾病研究

△E-mail:shuiqing_2001@sina.com