楊　碩，張　嶺，龔海英，張永亮，李靈芝，，高宏生（1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津00070；.武警后勤學(xué)院藥物化學(xué)教研室，天津0009；.天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室，天津0009）

·中藥研究·

蕨麻正丁醇部位下調(diào)缺氧內(nèi)皮細胞HIF-1α及ET-1表達*

楊碩1，2，張嶺2，龔海英2，張永亮3，李靈芝2，3，高宏生3
（1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2.武警后勤學(xué)院藥物化學(xué)教研室，天津300309；3.天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室，天津300309）

［目的］探討蕨麻正丁醇部位對內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護機制。［方法］采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（EA.hy926）建立缺氧損傷實驗?zāi)Ｐ?，實驗設(shè)常氧對照組、缺氧模型組、高（3.00 g/L）、中（1.50 g/L）、低濃度（0.75 g/L）蕨麻正丁醇部位組，復(fù)方丹參（3.0 g/L）組。胎盤蘭染色法測定各組細胞存活率；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測各組缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）mRNA和內(nèi)皮素-1（ET-1）mRNA表達，免疫細胞化學(xué)染色及Western Blot方法檢測HIF-1α蛋白表達。放免法測定培養(yǎng)基中ET-1的活性。［結(jié)果］與對照組比較，缺氧模型組細胞存活率顯著降低，HIF-1α和ET-1 mRNA及蛋白表達增加（P＜0.01）；蕨麻正丁醇部位各劑量組與缺氧模型組比較，細胞存活率顯著升高，高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位組、復(fù)方丹參組細胞HIF-1α和ET-1 mRNA及蛋白水平顯著降低（P＜0.01）。［結(jié)論］在缺氧狀態(tài)下，蕨麻正丁醇部位可能通過HIF-1α途徑調(diào)控靶基因的表達，從而發(fā)揮保護作用。

蕨麻；內(nèi)皮細胞；缺氧；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；內(nèi)皮素-1

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.10

血管內(nèi)皮細胞既是感應(yīng)細胞，又是效應(yīng)細胞，它能感知血液中的炎性信號、激素水平、壓力變化等信息，并能通過分泌血管活性物質(zhì)作出應(yīng)對。內(nèi)皮細胞的損傷及功能紊亂與高血壓、冠心病、慢性腎功能衰竭等多種疾病密切相關(guān)。因此，如何保護和修復(fù)內(nèi)皮細胞功能對改善血管疾病具有積極意義。

藏藥蕨麻具有顯著的抗缺氧［1］、抗氧化［1-2］及抗疲勞作用［3］。課題組前期研究證實蕨麻正丁醇部位是其抗缺氧主要活性部位，可通過抗氧化、抑制鈣超載、抗凋亡等途徑，對心肌細胞缺氧損傷［4-5］、神經(jīng)細胞缺氧損傷［6-7］、小鼠急性心肌缺血損傷［8-9］等發(fā)揮保護作用，研究還顯示蕨麻正丁醇部位內(nèi)皮細胞缺氧損傷也具有顯著的保護作用［10-11］，但對其抗內(nèi)皮細胞缺氧的機制尚未進行深入研究。本實驗進一步采用EA.hy926內(nèi)皮細胞缺氧模型，研究了蕨麻正丁醇部位對缺氧內(nèi)皮細胞缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）α亞型及其靶基因內(nèi)皮素-1（ET-1）mRNA及蛋白表達的影響，探討其對內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1藥品與試劑蕨麻用75%乙醇提取濃縮得浸膏，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇萃取液減壓濃縮并冷凍干燥后得正丁醇部位（每克相當于蕨麻生藥59 g）。陽性對照藥取復(fù)方丹參滴丸按照《中國藥典》（2005版）方法制備。高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco），無糖DMEM培養(yǎng)基（Sigma），青霉素、鏈霉素（Amresco），胰蛋白酶（Difco），噻唑蘭（北京鼎國生物技術(shù)開發(fā)中心）。ET-1試劑盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司），ET-1引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，濃縮型HIF-1α多克隆抗體（Santa Cruz）；HIF-1α及β-actin引物由Invitrogen公司合成。

1.1.2實驗設(shè)備二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（forma3111，美國），酶標儀（680 BIORAD，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus CK-40，日本），顯微鏡（Olympus CH-2）、PCR儀（PT-0200，美國）、核酸定量儀（德國）、凝膠成像分析系統(tǒng)（GelPro 4.5，美國）、電泳儀（Bio-Rad，美國）、電轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國）。

1.2方法

1.2.1分組及內(nèi)皮細胞缺氧損傷模型建立將EA. hy926內(nèi)皮細胞隨機分為常氧對照組（C組）；缺氧損傷模型組（M組）；蕨麻正丁醇部位高劑量組（H組，3 g/L）、中劑量組（I組，1.5 g/L）、低劑量組（L組，0.75 g/L）；復(fù)方丹參組（P組，3 g/L）。正丁醇部位及復(fù)方丹參滴丸均以少量二甲基亞砜（DMSO）（控制培養(yǎng)基中DMSO終濃度低于0.25%）溶解后加無糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，C組和M組均加含有等濃度DMSO的無糖DMEM培養(yǎng)基。除C組外，其他各組均于37℃下在無糖DMEM培養(yǎng)基中95%氮氣（N2）+5%CO2［氧氣（O2）濃度＜1%］環(huán)境下培養(yǎng)2 h，C組于5%CO2條件下37℃同步培養(yǎng)于無糖DMEM培養(yǎng)基中。每組8個復(fù)孔，重復(fù)2次。

1.2.2臺盼藍染色觀察細胞存活率各實驗組細胞加入1 mL 0.04%的臺盼藍溶液，光鏡下計數(shù)拒染細胞，按下式計算細胞存活率并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

細胞存活率=據(jù)染細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%

1.2.3RT-PCR法檢測細胞HIF-1α mRNA和ET-1 mRNA水平引物設(shè)計：根據(jù)Genbank中大鼠HIF-1α、ET-1基因序列設(shè)計引物。

HIF-1α上游：5′-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-3′，下游：5′-CCCTGCAGTAG GTTTCTGCT-3′，擴增產(chǎn)物長度為458 bp。

ET-1上游：5′-TTCTCTCTGCTGTTTGTGG-3′，下游：5′-CAATGTGCTCGGTT GTG-3′，擴增產(chǎn)物長度為614 bp。

β-actin上游：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA -3′，下游：5′-CTTCCTTAATGT CACGCACGATTTC -3′，擴增產(chǎn)物長度為547 bp。

RT-PCR反應(yīng)：用Trizol試劑提取總RNA，取1μL 總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第1條鏈，取5 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR。

HIF-1α反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃30s、62℃30 s、72℃30 s，循環(huán)30次，72℃延伸5 min。

ET-1反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃45 s、62℃45 s、72℃30 s，循環(huán)28次，72℃延伸5 min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測：用凝膠成像分析系統(tǒng)測出各擴增條帶的光密度值（A），以同一樣品HIF-1α或ET-1擴增帶的光密度（Af）與β-actin擴增帶的光密度（Ab）比值進行統(tǒng)計分析，得到其RT-PCR產(chǎn)物的相對含量。

1.2.4免疫細胞化學(xué)法檢測內(nèi)皮細胞HIF-1α蛋白內(nèi)皮細胞以丙酮固定，3%雙氧水（H2O2）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加1∶200稀釋的HIF-1α一抗4℃過夜，加生物素化二抗37℃15 min，加SP復(fù)合物，37℃30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。陽性反應(yīng)為胞核或胞漿染成棕黃色。陰性對照以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗，其余步驟相同。

1.2.5Western blot方法檢測內(nèi)皮細胞HIF-1α蛋白提取總蛋白，考馬斯亮藍法定量蛋白質(zhì)，進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%BSA室溫封阻1h；加入一抗（1∶1000）4℃過夜，二抗37℃1 h，SP復(fù)合物室溫1 h，DAB顯色。以同一樣品HIF-1α條帶的光密度與β-actin的光密度比值為相對蛋白含量。

1.2.6放免法檢測ET-1活性實驗操作按試劑盒進行。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，若方差采用LSD法，若方差不齊則采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1臺盼藍染色結(jié)果常氧對照組細胞未被臺盼藍染色；缺氧模型組可見大片藍染細胞，細胞連接斷開并成片狀脫壁；H組壞死細胞明顯減少，僅見散在藍染細胞，未見細胞脫壁現(xiàn)象；I組藍染細胞散在，與模型組相比，數(shù)量明顯減少，但藍染細胞數(shù)量比H組稍有增高；L組藍染細胞數(shù)量比模型組減少；復(fù)方丹參組可見散在藍染細胞，數(shù)量與I組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　蕨麻正丁醇部位對缺氧損傷內(nèi)皮細胞存活率的影響Tab.1　The effect of N-butanol extract of Potentilla anserina L.onsurvivalof endothelialcellsexposedtohypoxia

表1　蕨麻正丁醇部位對缺氧損傷內(nèi)皮細胞存活率的影響Tab.1　The effect of N-butanol extract of Potentilla anserina L.onsurvivalof endothelialcellsexposedtohypoxia

注：與常氧對照組比較，*P＜0.01；與缺氧模型組比較，#P＜0.01；與蕨麻正丁醇部位I組比較，△P＜0.01；與蕨麻正丁醇部位M組比較，▲P＜0.01。

組別細胞存活率（%）常氧對照組99.0±0.7缺氧模型組71.0±1.0*復(fù)方丹參滴丸組82.0±9.6#△▲蕨麻正丁醇部位H組88.0±1.6#△▲蕨麻正丁醇部位I組81.0±1.7#▲蕨麻正丁醇部位M組75.0±0.9#△n666666劑量（g/L）--3.00 3.00 1.50 0.75

2.2RT-PCR檢測結(jié)果常氧對照組細胞未見HIF-1α表達，與常氧對照組相比，缺氧模型組細胞HIF-1α mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）。H、I、L組及復(fù)方丹參組細胞HIF-1α mRNA水平與缺氧模型組比較均顯著降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1　各組內(nèi)皮細胞HIF-1α mRNA表達水平Fig.1　The expression of HIF-1α mRNA in endothelial cells of each group

缺氧模型組ET-1mRNA表達水平較常氧對照組顯著升高（P＜0.01）。H、I組及復(fù)方丹參組細胞ET-1 mRNA表達水平均較缺氧模型組降低（P＜0.01），L組無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2　各組內(nèi)皮細胞ET-1 mRNA表達水平Fig.2　The expression of ET-1 mRNA in endothelial cells of each group

2.3免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果對照組胞漿偶見HIF-1α蛋白免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)，為棕黃色顆粒。缺氧模型組較對照組細胞HIF-1α蛋白水平升高，胞漿免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)增多，胞核也出現(xiàn)表達。與缺氧模型組比較，H、I及復(fù)方丹參組細胞HIF-1α蛋白免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)減少，且大部分在胞漿表達。見圖3。

2.4Western blot檢測結(jié)果常氧對照組細胞未檢測到HIF-1α蛋白，缺氧模型組HIF-1α水平較常

圖3　各組內(nèi)皮細胞HIF-1α蛋白水平（×200）Fig.3　The level of HIF-1α protein in endothelial cells of each group

圖4　各組內(nèi)皮細胞HIF-1α蛋白表達水平Fig.4The level of HIF-1α protein in endothelial cells of each group

氧對照組升高（P＜0.01）。與缺氧模型組比較，H、I、L 組HIF-1α水平降低（P＜0.01）。見圖4。2.5放免法測定結(jié)果與常氧對照組比較，缺氧損傷模型組細胞ET-1水平升高（P＜0.01）；而蕨麻正丁醇部位各劑量組、復(fù)方丹參組與缺氧模型組相比ET-1水平均降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5　各組內(nèi)皮細胞ET-1活性Fig.5The activity of ET-1 in endothelial cells of each group

3　討論

細胞缺氧合并培養(yǎng)介質(zhì)缺糖是目前公認的造成體外缺血缺氧的模型。本實驗室以無糖DMEM培養(yǎng)基結(jié)合95%N2+5%CO2的缺氧缺糖環(huán)境模擬體內(nèi)內(nèi)皮細胞缺血缺氧，臺盼藍染色結(jié)果顯示，缺氧2 h細胞大量被藍染，細胞存活率降低28%，表明已經(jīng)有效地造成了細胞的缺氧損傷。蕨麻正丁醇部位干預(yù)后，可顯著減少藍染細胞數(shù)，提高缺氧狀態(tài)下細胞存活率，表明蕨麻正丁醇部位對內(nèi)皮細胞缺氧損傷具有保護作用。復(fù)方丹參滴丸是臨床廣泛用于治療心血管疾病的藥物［12］，在本模型中也能夠顯著提高缺氧內(nèi)皮細胞的存活率。

缺氧可激活多種轉(zhuǎn)錄因子，從而介導(dǎo)缺氧相關(guān)基因表達變化，是諸多疾病的病理生理過程。HIF-1廣泛表達于哺乳動物的各種組織細胞，是介導(dǎo)哺乳動物細胞低氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進組織細胞對低氧的適應(yīng)性。HIF-1是由α和β亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧調(diào)控并調(diào)節(jié)HIF-1的活性，β亞基則屬結(jié)構(gòu)型表達［13］。常氧條件下，HIF-1α可被脯氨酰-4-羥化酶羥基化，隨即被泛素-蛋白酶體通路迅速降解，故常氧時，人、小鼠、大鼠體內(nèi)許多組織中均可檢測到HIF-1αmRNA、HIF-1βmRNA和HIF-1β蛋白，但一般檢測不到HIF-1α蛋白［14］。在缺氧等條件下HIF-1α和HIF-1β均能通過核轉(zhuǎn)位由胞質(zhì)進入胞核，形成穩(wěn)定的異二聚體，活化的HIF-1在其靶基因的轉(zhuǎn)錄起始部位形成一個轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動對靶基因的轉(zhuǎn)錄［15］。本研究在常氧對照組檢測到了HIF-1α mRNA，但僅在胞漿檢測到極微量HIF-1α蛋白，與文獻報道相吻合。但缺氧模型組HIF-1αmRNA水平升高，且在胞漿和胞核均檢測到了HIF-1α蛋白，表明缺氧促進了HIF-1α基因的表達和核轉(zhuǎn)位，同時抑制了HIF-1α蛋白的降解，導(dǎo)致蛋白積聚并發(fā)揮調(diào)控作用。不同濃度的蕨麻正丁醇部位干預(yù)后，HIF-1 αmRNA表達水平較模型組明顯降低，HIF-1α蛋白表達水平也降低，提示蕨麻正丁醇部位對內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護作用與其對HIF-1α表達的調(diào)控有關(guān)。

ET-1主要由血管內(nèi)皮細胞分泌，在血管內(nèi)皮細胞損傷時可大量分泌，因此ET-1是目前測定血管內(nèi)皮細胞損傷的重要手段之一。ET-1是HIF-1下游基因，其表達可由HIF-1直接激活［16-17］。文獻報道丹參酮ⅡA可在腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞EVC304損傷模型中降低ET-1水平［18］，本研究結(jié)果顯示：缺氧損傷模型組ET-1水平顯著升高，而復(fù)方丹參組和蕨麻正丁醇部位干預(yù)組ET-1水平則顯著下調(diào)，與HIF-1α的變化一致，提示蕨麻正丁醇部位可能通過HIF-1α途徑調(diào)節(jié)靶基因的表達，從而在缺氧時對內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用。

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（本文編輯：高杉，馬曉輝）

Study of N-butanol extract of Potentilla anserina L.in down-regulating expression levels of HIF-1α and ET-1 in hypoxia endothelial cells

YANG Shuo1，2，ZHANG Ling2，GONG Hai-ying2，ZHANG Yong-liang3，LI Ling-zhi2，3，GAO Hong-sheng3
（1.Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300309，China；3.Tianjin Key Laboratory for Prevention and Control of Occupational and Environmental Hazards，Tianjin 300309，China）

［Objective］To study the protective effect of n-butanol extract of Potentilla anserine L.on EA.hy926 endothelial cells exposed to hypoxia.［Methods］The model of hypoxia injury was established with human umbilical vein endothelial cell line（EA.hy926）.The cell death was determined by Trypan blue staining assay.The expression levels of HIF-1α and ET-1 mRNA were detected by reverse transcription-PCR assay.The Western blot and imuunocytochemistry were used for determining HIF-1α protein.The ET-1 protein was detected with radioimmunoassay.［Results］Compared with control group，the survival rate of cell was significantly increased after pretreated with 3，1.5 and 0.75 g/L of n-butanol extract of Potentilla anserine L.Meanwhile，the mRNAs of HIF-1 and ET-1 and their protein products were significantly decreased.［Conclusion］Potentilla anserina L.could exert its protective effect on endothelial cells during hypoxia injury by modulating expression of target genes through HIF-1α pathway.

Potentilla anserina L.；endothelial cell；hypoxia；hypoxia inducible factor-1；endothelin-1

R285.5

A

1672-1519（2015）03-0168-05

國家自然科學(xué)基金項目（81073152）；天津市重點基金項目（12JCZDJC34700）；中國博士后基金項目（20100470106）。

楊碩（1986-），男，2011級碩士研究生，主要從事抗缺氧藥物研究。

李靈芝，E-mail：13682196000@163.com；張永亮，E-mail:zhang78127@tom.com。

（2014-09-24）