孫許朋 ，楊世平 ，武紅艷 ，郭娟寧 ，岳俊濤 ，樊愛英

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院法醫(yī)學系，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.許昌市公安局犯罪偵查支隊，河南 許昌 461000）

Y染色體呈父系遺傳，不易受重組和回復突變的影響，在涉及性犯罪、追溯父系同代、隔代親權鑒定等方面具有應用價值。本研究對河南漢族人群16個YSNP位點的多態(tài)性進行調(diào)查，旨在為法醫(yī)學應用和群體進化研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與位點選擇

收集由許昌市公安局犯罪偵查支隊提供的176份河南地區(qū)漢族男性無關個體血樣。常規(guī)Chelex-100法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)國際Y染色體協(xié)會提出的系統(tǒng)樹[1]，挑選在東亞群體中多態(tài)性較好的16個Y-SNP位點（M9、M89、M95、M119、M122、M214、P136、P148、P164、P191、P196、P197、P198、P199、P200、P201）。 用 Primer Premier 5.0軟件自行設計PCR擴增引物和SNaPshot微測序引物，由大連寶生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 16個Y-SNP位點的引物序列和SNaPshot微測序引物

1.2 擴增

分別對男性DNA樣本的16個Y-SNP位點進行單獨擴增以驗證其準確性，PCR擴增體系為25 μL，包括：1×PCR 緩沖液、200 μmol/L dNTPs、2.0 mmol/L MgCl2、1U AmpliTaq Gold?DNA聚合酶。擴增條件：94℃ 11 min；94℃ 60 s，62 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，32 個循環(huán)；72℃ 15min。

1.3 SNaPshot微測序

SNaPshot微測序反應前取1.5 μL PCR產(chǎn)物，加入0.5 U蝦堿性磷酸酶 1 U/μL，2 U核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ） 10U/μL，置入 2720型擴增儀（美國 AB 公司）進行反應，37℃孵化60min，80℃滅活15min。

SNaPshot微測序采用5μL反應體系，內(nèi)含1.5μL SNaPshot反應混合液，1.5 μL純化后的PCR產(chǎn)物和1μL單堿基延伸引物。 循環(huán)條件：96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 30s，共25個循環(huán)。向SNaPshot微測序反應的產(chǎn)物中加入1 U蝦堿性磷酸酶 （1 U/μL），37℃孵化60min，80℃變性 15min。

1.4 電泳檢測

PCR擴增產(chǎn)物采用3130遺傳分析儀進行毛細管電泳，GeneMapper?ID v3.2軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學分析

用直接計數(shù)法計算各基因座等位基因頻率及單倍型頻率，基因多樣性（gene diversity，GD）及單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）計算均按公式：GD（HD）=n[1-Σ（Pi）2]/（n-1）[2]。 式中 n 為樣本數(shù)，Pi為基因頻率或單倍型頻率。

2 結果與討論

對16個Y-SNP位點分別成功進行了擴增，其片段大小為100～400bp。16個Y-SNP位點在河南漢族群體均呈多態(tài)性分布。其等位基因頻率和單倍型頻率分布及群體遺傳學參數(shù)詳見表2～3。

表2 河南漢族群體16個Y-SNP位點的基因頻率和基因多樣性 （n=176）

表3 河南漢族群體18種單倍型頻率分布 （n=176）

本研究16個Y-SNP位點多態(tài)性分布較好，GD為0.1104～0.5016，M95的GD值最低。由于Y染色體上的遺傳標記存在連鎖，故實際檢出的單倍型數(shù)量要遠遠低于理論上可能組合的數(shù)量。本研究在176個男性個體中共檢出18種單倍型，其中頻率最高的為0.1420，頻率最低的僅0.0114。HD達到0.9248，具有較高的個體識別率和非父排除率，在法醫(yī)學應用中具有較高的價值，同時也可作為Y-STR標記的有效補充。為今后進一步在增加樣本量及Y-SNP位點數(shù)基礎上研究中國人群的遺傳結構特征及群體間的相互關系提供了寶貴的遺傳資料。