李周儒 ，滕道輝 ，董國(guó)凱 ，殷文江 ，蔡紅星

（1.徐州醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，江蘇 徐州 221002；2.徐州市銅山區(qū)公安局刑警大隊(duì)，江蘇 徐州 221100）

損傷時(shí)間是指從受傷到死亡所經(jīng)歷的時(shí)間，推斷損傷時(shí)間是法醫(yī)病理學(xué)研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)[1]。腦損傷是法醫(yī)學(xué)檢案常見(jiàn)的死亡原因，腦損傷時(shí)間的準(zhǔn)確推斷能為案件的偵破提供重要線索。

腦損傷后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)生凋亡，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族是與凋亡密切相關(guān)的調(diào)節(jié)基因，而caspase-3是家族中最重要的凋亡執(zhí)行者[2-3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，caspase-3在腦挫傷后呈現(xiàn)一定的時(shí)序性變化。而造血干細(xì)胞特異性相關(guān)結(jié)合蛋白-1（HCLS1-associated protein X-1，HAX-1）是一種新的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白，具有強(qiáng)大的凋亡抑制作用[6-7]。

基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦挫傷模型，利用Western印跡法、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick-end la-beling，TUNEL）和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)腦挫傷后凋亡蛋白caspase-3及抗凋亡蛋白HAX-1在不同時(shí)間段表達(dá)的變化規(guī)律，從而為腦損傷時(shí)間的推斷提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康SD雄性大鼠80只（徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量（190±30）g。

caspase-3（sc-22139）一抗、β-actin（sc-130656）一抗、HAX-1（sc-34273）一抗（美國(guó) Santa Cruz公司），AP標(biāo)記的二抗（美國(guó)Sigma Chemical公司），驢抗兔熒光二抗（A21207，美國(guó) Invitrogen公司），BCA 試劑盒（浙江碧云天生物試劑有限公司），TUNEL試劑盒（北京中山生物試劑公司），NBT/BCIP試劑盒（美國(guó)Promega公司）。

ZH-ZYQ型自由落體腦損傷模型打擊器（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），JD801病理圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的建立

Western印跡法和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)各用40只大鼠，40只大鼠隨機(jī)分為正常組，假手術(shù)組，顱腦損傷后 2h、6h、12h、1d、3d、7d 組，每組 5 只。

利用自由落體腦損傷模型打擊器建立大鼠腦挫傷模型：大鼠用20%水合氯醛（350g/kg）腹腔麻醉后，俯臥位固定頭部及四肢，除去頭皮處鼠毛。用手術(shù)刀切開大鼠頭部中線皮膚，切口后端以45°角向左前下延伸，形成三角形皮瓣。向頭側(cè)翻開皮瓣，剝離骨膜，充分暴露左側(cè)露骨。以左側(cè)顱骨眼眶凹陷為支撐點(diǎn)，用持針器咬開，暴露硬腦膜，并向后在左頂骨擴(kuò)大成直徑6mm的圓形骨窗，注意保護(hù)腦膜。將撞桿頭端置于骨窗硬腦膜外，其外垂直金屬套管，用40g打擊棒（圓柱形，直徑1.3cm，高5.3cm，打擊棒頭部球形直徑3mm）沿外周金屬管從25cm高度自由落下沖擊撞針，造成大鼠左側(cè)局部腦挫裂傷。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)步驟與腦挫傷模型相同，但不用打擊棒打擊動(dòng)物頭部。正常組及假手術(shù)組均在相應(yīng)部位進(jìn)行取材作為對(duì)照。

1.2.2 蛋白樣品制備及Western印跡法檢測(cè)

在腦挫傷模型建立后 2 h、6 h、12 h、l d、3 d 和 7 d各取5只直接斷頸處死，以挫傷灶為中心做腦冠狀切面取材（大小為3 mm×3 mm×2 mm），置液氮中凍存，備用。進(jìn)行組織樣品的提取及caspase-3和HAX-1蛋白含量的測(cè)定，分裝，置-80℃冰箱待用。

等量蛋白樣品經(jīng)7.5%SDS聚丙烯凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)3%BSA封閉后加入一抗4℃過(guò)夜。用洗滌液洗膜，加入相應(yīng)的二抗，37℃反應(yīng)2h，洗膜。以NBT/BCIP顯色，結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)處理，蛋白表達(dá)水平以目的蛋白與對(duì)照蛋白（β-actin）的比值來(lái)表示。

1.2.3 TUNEL染色及激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)

分別在建立大鼠腦挫傷模型后的各時(shí)間點(diǎn)，用20%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉大鼠，于劍突下橫向沿胸壁左右向剪開暴露心臟，用平頭穿刺針從心尖插入左心室，剪開右心耳，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛溶液灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液后固定6 h，30%的蔗糖脫水至腦組織下沉，OCT包埋。切片，厚度25μm。取冰凍切片，0.4%的Triton X-100-PBS打孔15min，4℃血清封閉1h，加入 HAX-1一抗4℃過(guò)夜，0.1%Triton X-100-PBS洗滌5 min×3次，加入熒光二抗，避光室溫孵育2h，甘油-PBS封片，激光共聚焦顯微鏡掃描圖片。紅色熒光為HAX-1，代表HAX-1的陽(yáng)性細(xì)胞。

參照試劑盒上的說(shuō)明書，提取樣品組織的冰凍切片，貼片，用TUNEL反應(yīng)液在濕盒內(nèi)37℃避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗片 10 min×3次，甘油-PBS封片，激光共聚焦顯微鏡掃描圖片。綠色熒光為TUNEL染色細(xì)胞，代表凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Western印跡法檢測(cè)腦挫傷后caspase-3和HAX-1的表達(dá)

蛋白半定量結(jié)果顯示：腦挫傷后caspase-3表達(dá)開始升高，與正常組及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），6 h～1 d 逐漸升高，至傷后 3 d 左右，caspase-3表達(dá)強(qiáng)度達(dá)峰值（P＜0.05），此后開始下降，但7d左右仍維持在較高表達(dá)水平（P＜0.05）（圖1A）。HAX-1在正常組及假手術(shù)組有低表達(dá)，傷后2h在損傷部位的表達(dá)開始升高，與正常組及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），傷后 6 h，HAX-1 表達(dá)強(qiáng)度達(dá)峰值（P＜0.05），隨后逐漸下降，但傷后 12 h～1 d，HAX-1 表達(dá)仍高于正常水平（P＜0.05），至傷后 3～7d幾乎測(cè)不到（圖1B）。

圖1 腦挫傷后各組caspase-3和HAX-1的半定量結(jié)果

2.2 激光共聚焦顯微鏡下腦挫傷后HAX-1陽(yáng)性細(xì)胞和TUNEL染色細(xì)胞

正常組及假手術(shù)組HAX-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少。腦損傷后2h HAX-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），傷后 6 h左右最多（P＜0.05），12 h后逐漸下降，傷后 3 d HAX-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)極少（圖2A）。

正常組及假手術(shù)組TUNEL染色細(xì)胞數(shù)較少，存活細(xì)胞最多。傷后2h，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；此后逐漸增多，至傷后3 d左右凋亡細(xì)胞數(shù)最多（P＜0.05），此后逐漸下降，但7 d左右與正常組比較仍維持較高水平（P＜0.05，圖 2B）。

圖2 腦挫傷后激光共聚焦顯微鏡下各組HAX-1陽(yáng)性細(xì)胞及TUNEL染色細(xì)胞的表達(dá)

腦挫傷后激光共聚焦顯微鏡下HAX-1及TUNEL染色細(xì)胞的變化見(jiàn)圖3～4。

圖3 腦挫傷后激光共聚焦顯微鏡下HAX-1陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá) ×100

圖4 腦挫傷后激光共聚焦顯微鏡下TUNEL染色細(xì)胞的表達(dá) ×100

3 討 論

腦損傷時(shí)間推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究的重要課題，推斷腦損傷時(shí)間能為案件的偵破提供重要線索，在縮小偵察范圍等方面提供幫助。法醫(yī)病理學(xué)者在檢測(cè)腦內(nèi)多種生物活性物質(zhì)的時(shí)序性表達(dá)方面進(jìn)行了大量研究[8-10]。

caspase-3是重要的凋亡執(zhí)行者，能切割不同的底物，從而放大蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，既參與凋亡啟動(dòng)，又參與凋亡程序執(zhí)行，尤其在凋亡執(zhí)行階段，負(fù)責(zé)對(duì)全部或部分關(guān)鍵蛋白進(jìn)行酶切（激活或滅活），與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[11-13]。caspase-3在腦及皮膚損傷等方面已有大量的研究[4，14-15]，也證實(shí)了其作為一種指標(biāo)可以用來(lái)推斷腦損傷時(shí)間[5]。HAX-1是能與造血系統(tǒng)細(xì)胞特異性蛋白1（hematopoietic lineage cell-specific protein 1，HS1）存在相互作用的蛋白，廣泛表達(dá)于多種組織、細(xì)胞的線粒體內(nèi)，少數(shù)分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上[16-17]，能夠在腦部缺血缺氧過(guò)程中降低caspase-3的活性，抑制細(xì)胞的凋亡，HAX-1過(guò)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了HAX-1對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用[18]。上述研究主要運(yùn)用了傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)及圖像處理技術(shù)進(jìn)行分析，本實(shí)驗(yàn)加入激光共聚焦顯微鏡免疫組化檢測(cè)方法，進(jìn)一步增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、客觀性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caspase-3蛋白定量趨勢(shì)與TUNEL染色細(xì)胞表達(dá)趨勢(shì)基本平行，且損傷當(dāng)時(shí)二者均開始升高，3d左右達(dá)峰值，后逐漸下降，但7d左右仍維持較高水平。因此認(rèn)為，可以用TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡及caspase-3蛋白定量來(lái)推斷腦損傷經(jīng)過(guò)時(shí)間。

在腦損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[12-13]中發(fā)現(xiàn)，全腦缺血再灌注后皮質(zhì)神經(jīng)元中HAX-1在短期缺血中表達(dá)升高，可能參與神經(jīng)元的抗凋亡，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)水平降低，與神經(jīng)元的凋亡增強(qiáng)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HAX-1在腦挫傷后2h表達(dá)開始升高，傷后6h左右達(dá)峰值，隨后逐漸下降，3d后低于正常水平。因此認(rèn)為，HAX-1免疫組化染色可以用于腦損傷時(shí)間的推斷。

本實(shí)驗(yàn)表明，在腦挫傷后凋亡蛋白caspase-3和抗凋亡蛋白HAX-1的表達(dá)均具有時(shí)序性變化，可以用來(lái)推斷腦損傷時(shí)間。在損傷早期，HAX-1隨著細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)會(huì)大量表達(dá)，達(dá)到抑制凋亡的作用，但在損傷后，凋亡是個(gè)不可逆的過(guò)程，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡蛋白表達(dá)越來(lái)越多，而HAX-1受到抑制，表達(dá)慢慢下降。因此，可以認(rèn)為HAX-1適用于早期腦損傷時(shí)間的推斷，而caspase-3適用于稍晚期腦損傷時(shí)間的推斷。

Jitkaew等[19]認(rèn)為HAX-1的抗凋亡作用是通過(guò)抑制caspase-3途徑發(fā)揮作用的。Lee等[7]研究表明，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中HAX-1細(xì)胞內(nèi)水平受caspase-3調(diào)節(jié)。綜上，我們推測(cè)在某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)抗凋亡蛋白HAX-1和凋亡蛋白caspase-3兩者的表達(dá)更有利于腦損傷時(shí)間的推斷，且聯(lián)合應(yīng)用更多的指標(biāo)，綜合判斷、分析，對(duì)于腦損傷時(shí)間推斷具有更大價(jià)值，更具科學(xué)性和準(zhǔn)確性。