楊玉前

[摘要] 目的 比較T細胞檢測和熒光PCR檢測兩種方法對結(jié)核分枝桿菌檢測的敏感性、特異性，及在基層結(jié)核病防治工作中的應(yīng)用前景。方法 應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌熒光PCR檢測2013年10月1日—2014年10月1日采集的194份疑似或確診活動性肺結(jié)核空腹痰標本，并與血液T細胞檢測結(jié)果進行比較。結(jié)果 熒光PCR法與T細胞檢測對結(jié)核分枝桿菌檢測的陽性率為12.9%和7.7%，確診率分別為56%和93.3%。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌T細胞檢測相比熒光PCR檢測的特異性較高，而敏感性相對較差，在臨床實踐中由于各種干擾因素的存在，兩者結(jié)合應(yīng)用可提高結(jié)核病的早期診斷率。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；熒光PCR；T細胞檢測

[中圖分類號] R37 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）01（c）-0005-02

[Abstract] Objective To compare the sensitivity and specificity between T cell assay and fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis， and the application prospect in grassroot work of tuberculosis control and prevention. Methods Fluorescent PCR assay was used to detect the Mycobacterium tuberculosis in 194 fasting sputum specimens of suspected or confirmed active tuberculosis collected from October the first 2013 to October the first 2014， and the results were compared with those of blood T cell assay. Results The positive rate of fluorescent PCR assay and T cell assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis was 12.9% and 7.7%， respectively， the diagnosis rate was 56% and 93.3%， respectively. Conclusion The specificity of T cell assay is higher while the sensitivity is poorer compared to the fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis. As there are various interfering factors existing in the clinical practice， combinative application of the two methods can improve the early diagnosis rate of tuberculosis.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Fluorescent PCR； T cell assay

由于結(jié)核病是呼吸道傳染病且耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，目前結(jié)核的流行有不斷上升的趨勢，據(jù)資料顯示，全世界約有30%的人受到結(jié)核的感染，10%的人最終發(fā)展為結(jié)核病患者，全世界每年新發(fā)結(jié)核病例1 000萬，死亡病例300萬。一些惡性疾病常易合并各種細菌、真菌及結(jié)核等感染[1]，因此，結(jié)核病防治引起全世界的廣泛關(guān)注，早期發(fā)現(xiàn)可疑的結(jié)核病患者并實施有效監(jiān)控、治療是衛(wèi)生工作者的重要任務(wù)[2]。傳統(tǒng)的結(jié)核實驗室診斷技術(shù)如痰涂片、培養(yǎng)、鑒定等存在敏感性低或耗時過長等缺點，在實際應(yīng)用中有一定的局限[3]，不利于早期快速診斷。近年來，分子生物學(xué)方法開始應(yīng)用于結(jié)核的臨床診斷和療效判定[4-5]。該研究應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌熒光定性PCR和T細胞檢測兩種方法對2013年10月1日—2014年10月1日采集的194名疑似結(jié)核病患者痰液和血液標本進行結(jié)核分枝桿菌進行快速檢測，并做出初步的分析評價，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集南陽市第六人民醫(yī)院194名疑似結(jié)核病患者，其中男104例，女90例，平均年齡（31.9±5.1）歲。

1.2 試劑和儀器

結(jié)核桿菌T細胞檢測試劑盒購自北京表源生物技術(shù)有限公司，結(jié)核桿菌熒光PCR試劑盒采購自廣州健侖生物科技有限公司，儀器主要有高速臺式離心機，PCR擴增儀，美國Turner Designs公司TD-360型熒光儀。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)核分枝桿菌熒光PCR檢測操作步驟 （1）痰液樣本處理：①取病人晨痰，加入2倍體積的4% NaOH，反復(fù)振搖，置室溫20 min，使之充分液化。②取0.5 mL液化痰液加至0.5 mL離心管內(nèi)，于高速臺式離心機1.4萬轉(zhuǎn)/分離心10 min，棄上清液。③加滅菌蒸餾水0.5 mL于沉淀中，振蕩混勻，1.4萬轉(zhuǎn)/分離心10 min，棄上清液。④ 重復(fù)步驟③。⑤加樣品提取液50 μL于沉淀中，振蕩混勻后，置100 ℃水浴中15 min，取出后，樣品管1.5萬轉(zhuǎn)/分離心5 min，上清液即可作為反應(yīng)模板。⑥強陽性對照、弱陽性對照和陰性對照不需用NaOH液化，直接從步驟②開始處理。（2）核酸擴增反應(yīng)：將反應(yīng)混合液放置于室溫后，取出20 μL加入含酶反應(yīng)管中，再加4 μL己處理的樣品上清（調(diào)零管中直接加入20 μL反應(yīng)混合液和4 μL樣品提取液），混勻后，1萬轉(zhuǎn)/分離心20 s，上PCR擴增儀循環(huán)。（3）熒光檢測：①儀器校準：反應(yīng)管在低于40 ℃的室溫下平衡5 min后進行測量。TD-360型熒光儀調(diào)零，校正。②樣品測定：將從PCR擴增儀中取出的反應(yīng)管逐一放入熒光儀中讀數(shù)。記錄數(shù)據(jù)。（4）結(jié)果判斷：樣品熒光強度≥100 為陽性，樣品熒光強度<100 為陰性。

結(jié)果判定：（1）強陽性對照的熒光讀值應(yīng)>300。（2）弱陽性對照的熒光讀值應(yīng)在100～150之間。（3）陰性對照的熒光讀值應(yīng)<65。

1.3.2 結(jié)核分枝桿菌T細胞檢測 （1）T細胞的分離：用肝素鋰抗凝采血管采集待檢者外周血6 mL，將血液與預(yù)熱至室溫的 RPMI1640 不完全培養(yǎng)液按照體積比 1：1 的比例混勻。按照混勻血樣與ficoll淋巴細胞分離液的體積比為2：1 的比例，小心的將血樣加在離心管中ficoll淋巴細胞分離液上層，離心細胞，將18 ℃× 1000 g離心20 min。收集細胞層。洗滌收集的細胞，18 ℃× 600 g離心 7 min。重復(fù)洗滌1次。將洗滌好的細胞重置于 2 mL AIM-V 培養(yǎng)液中，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為 2.5×106個/mL。（2）檢測：嚴格按照T細胞檢測試劑盒進行檢測。

結(jié)果判定：（1） 當(dāng)陰性對照孔斑點數(shù)若為 0～5 時，若 TB 刺激物孔比陰性孔紫色斑點數(shù)≥5 個，則判為陽性。反之，判為陰性。（2） 當(dāng)陰性孔紫色斑點數(shù)為≥6 時，若 TB 刺激物孔≥陰性孔紫色斑點數(shù)的 2 倍，則判為陽性。反之，判為陰性。

1.4 統(tǒng)計方法

該研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR檢測

194份痰標本進行結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測，其中25份呈陽性，陽性率為12.9%。

2.2 T細胞檢測

同時對這194例疑似患者的血液進行結(jié)核分枝桿菌T細胞檢測，結(jié)果共檢出陽性15例，陽性率為7.7%，兩種方法的結(jié)果比較，見表1。

2.3 熒光PCR與T細胞檢測比較

經(jīng)χ2檢驗，熒光PCR與T細胞檢測兩種方法的靈敏度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.36，P<0.01），特異性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.7，P<0.01）。

3 討論

近年來隨著國家對控制結(jié)核病力度的加大以及各級結(jié)核病防止機構(gòu)的努力，結(jié)核病得到了有效的控制，但不容否認的現(xiàn)實是結(jié)核病的發(fā)生較前15年的態(tài)勢有明顯的加重，結(jié)核病對人類的傷害和致殘影響巨大，必須盡早發(fā)現(xiàn)并控制其發(fā)展演進，但診斷結(jié)核病的金標準培養(yǎng)法由于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)周期較長，約需20 h左右才繁殖一代，3～4周以上才出現(xiàn)肉眼可見菌落[6]，影響了結(jié)核病的早期診斷和治療，且仍有約20%的結(jié)核病人由于各種因素導(dǎo)致無法通過培養(yǎng)確診。

近年來隨著熒光PCR檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用，對痰標本進行結(jié)核分枝桿菌特異性擴增、熒光檢測，可在1個工作日內(nèi)確診結(jié)核分枝桿菌感染與否，具有良好的應(yīng)用前景，靈敏度及特異性較高。文獻報道熒光PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感性、特異性較高[7-8]，可達到97%～99.6%[9]。但這項技術(shù)由于在標本的收集以及選用的引物與其他細菌有交叉序列而導(dǎo)致假陰性和假陽性的發(fā)生，使熒光PCR檢測技術(shù)有一定的局限性。因此，嚴格無菌操作和保證引物特異性是避免假陽性發(fā)生的關(guān)鍵。當(dāng)提取的DNA鏈受到破壞時會發(fā)生假陰性。

T細胞檢測技術(shù)基于感染結(jié)核分枝桿菌的機體存在結(jié)核特異性記憶T淋巴細胞，當(dāng)再次遇到結(jié)核特異性抗原刺激時，轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T淋巴細胞，釋放干擾素的免疫原理。這種方法的無菌條件易于達到，外界的污染和干擾很小，且患者處于免疫抑制狀態(tài)時不影響T細胞檢測的敏感性[10]，在診斷結(jié)核感染方面具有良好的敏感性和特異性[11]，在免疫低下的個體中具有更高診斷效能，對肺外結(jié)核的診斷敏感性較高，對那些不典型的菌陰肺結(jié)核及難以獲取檢測標本的肺外結(jié)核、兒童結(jié)核病診斷價值很高，在結(jié)核病的診斷中作用巨大[11]。

該研究熒光PCR技術(shù)比結(jié)核分枝桿菌T細胞檢測的敏感性高的結(jié)果，與國內(nèi)文獻報道類似[12]，結(jié)核分枝桿菌T細胞檢測結(jié)果達93.3%，特異性比較高，可能是由于該院是?？漆t(yī)院，且來該院的患者經(jīng)過外院的初步篩查，所有樣本患結(jié)核的比例本來就較大以及樣本數(shù)偏少造成的。但綜合考慮同時結(jié)合熒光PCR技術(shù)可達到對結(jié)核分枝桿菌準確、快速的檢測，在基層結(jié)核病的確診中具有重要的應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2014-10-23）