辛寶林　于秀坤

【摘要】 目的 探討利福平和異煙肼耐藥基因突變采用PCR線性雜交酶顯色法建立快速檢測(cè)方法的應(yīng)用價(jià)值。方法 88份送檢的結(jié)核病患者臨床標(biāo)本， 得結(jié)核分枝桿菌分離株64株， 采用PCR線性雜交酶顯色法建立利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)， 同時(shí)采用比例法檢測(cè)， 并以比例法為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)快速檢測(cè)方法的診斷價(jià)值。結(jié)果 快速檢測(cè)方法中對(duì)利福平耐藥24份， 僅對(duì)異煙肼耐藥24份， 對(duì)利福平和異煙肼均耐藥22份， 不耐藥18份。以耐藥不耐藥作為分割點(diǎn)， 比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)， 快速檢測(cè)方法的靈敏度100.0%， 特異度90.0%， 準(zhǔn)確度97.7%；兩種檢驗(yàn)方法一致性好（P>0.05）。結(jié)論 PCR線性雜交酶顯色法建立快速檢測(cè)方法可在12 h內(nèi)對(duì)利福平和異煙肼耐藥基因突變的作出判斷， 與比例法藥敏試驗(yàn)一致性好， 可信度高， 值得臨床推廣。

【關(guān)鍵詞】 利福平；異煙肼；耐藥；基因突變；結(jié)核分枝桿菌；快速檢測(cè)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.09.115

利福平和異煙肼是結(jié)核病的最重要的一線抗結(jié)核藥物[1]。近年來結(jié)核分枝桿菌基因突變發(fā)生耐藥的情況也時(shí)有發(fā)生， 世界衛(wèi)生組織報(bào)道每年有新增48.9萬(wàn)例耐多藥結(jié)核病， 其總量占結(jié)核病患者的4.8%， 而在我國(guó)則更為嚴(yán)重。耐多藥結(jié)核病的早期確診有利于患者的病情控制， 比例法藥敏試驗(yàn)雖然結(jié)果可靠， 且被公認(rèn)為判斷結(jié)核分枝桿菌耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)， 但該方法需要細(xì)菌培養(yǎng)， 耗時(shí)2～4個(gè)月， 易貽誤病情。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展， 為結(jié)核分枝桿菌耐藥性快速檢測(cè)提供可能。本中心采用PCR線性雜交酶顯色法建立利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測(cè)方法對(duì)送檢的疑似耐藥結(jié)核病患者臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)， 并將結(jié)果與比例法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行分析， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 取2013年10月～2015年5月送檢的疑似耐藥結(jié)核病患者臨床標(biāo)本88份， 其中痰65份， 肺泡灌洗23份。

1. 2 去污染處理 將1～2倍于痰及肺泡灌洗液樣本的4%NaOH放置于樣本中， 震蕩混勻， 靜置20 min， 再將pH=6.8的磷酸緩沖液加入樣本中， 3000 r/min離心1 min， 沉淀后去除上清液， 將1 ml磷酸緩沖液加入其中， 混勻， 獲得去污染樣本。

1. 3 方法

1. 3. 1 比例法藥敏試驗(yàn) 取適量去污染樣本在酸性固體羅氏培養(yǎng)基上接種， 在37℃溫度下培養(yǎng)7 d， 菌群鑒定采用齊-尼氏染色法， 共得結(jié)核分枝桿菌分離株64株。制備10-2 g/L和10-4 g/L菌懸液， 各取0.01 ml采用劃線法接種在含藥培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基表面， 37℃溫度下培養(yǎng)4周， ≤1%為敏感。

1. 3. 2 快速檢測(cè)方法的建立 采用PCR線性雜交酶顯色法建立快速檢測(cè)方法。取去污染樣本500 μl加入1.5 ml離心管， 以5600 r/min的速度離心15 min后去上清液， 加入去離子水500 μl， 再次以5600 r/min的速度離心15 min， 沸水浴20 min， 超聲裂解15 min， 取上清液5 μl為DNA模板。采用BLAST軟件對(duì)katG、inhA和rpoB基因合適的擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行引物擴(kuò)增， 其中katG基因2個(gè)探針， inhA基因2個(gè)探針， rpoB基因11個(gè)探針。PCR擴(kuò)增體系（引物1 μl， 2.5 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷混合物4 μl， 10×PCR緩沖液5 μl， MgCl2 3 μl， DNA聚合酶5.0 U， 去離子水3 μl， 提取的DNA模板5 μl）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：第一階段：95℃ 15 min， 95℃ 30 s， 58℃ 2 min， 10個(gè)循環(huán)；第二階段：95℃ 25 s， 53℃ 40 s， 70℃ 40 s， 30個(gè)循環(huán)；第三階段：70℃ 8 min。取20 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入雜交盤中， 與20 μl變性裂解液混勻， 室溫靜置5 min后， 加入1 ml雜交緩沖液， 放入探針試條。將雜交盤放入GTblot-20全自動(dòng)雜交儀， 雜交成功后取出試紙吸水紙干燥， 判讀。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2 檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

比例法藥敏試驗(yàn)中僅對(duì)利福平耐藥26份， 僅對(duì)異煙肼耐藥23份， 對(duì)利福平和異煙肼均耐藥19份， 不耐藥20份。快速檢測(cè)方法中對(duì)利福平耐藥24份， 僅對(duì)異煙肼耐藥24份， 對(duì)利福平和異煙肼均耐藥22份， 不耐藥18份。以耐藥不耐藥作為分割點(diǎn)， 比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)， 快速檢測(cè)方法的靈敏度100.0%（68/68）， 特異度90.0%（18/20）， 準(zhǔn)確度97.7%（86/88）， 兩種檢驗(yàn)方法一致性好（P=0.1573>0.05）。

3 討論

目前， 基于分子生物學(xué)研究的利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、實(shí)時(shí)PCR熔解曲線法、噬菌體法、基因芯片法及PCR線性雜交酶顯色法等， 后兩種方法應(yīng)用最為廣泛。這些方法預(yù)測(cè)耐藥表型均基于結(jié)核分枝桿菌的rpoB、katG和inhA基因特定區(qū)域或位點(diǎn)突變[2]。約96%的利福平耐藥性與rpoB突變相關(guān)， 30%～60%的異煙肼耐藥性與katG基因突變相關(guān)， 故上述基因區(qū)域可基本覆蓋耐藥基因突變情況， 為檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性提供保障。PCR線性雜交酶顯色法也可見于慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥研究[3]。該技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)時(shí)， 通過多重聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向雜交技術(shù)， 與固定在硝化纖維條帶上的特異基因雜交[4]， 顯色判讀。在此過程中PCR擴(kuò)增效果不受細(xì)菌存活量的影響、雜交后化學(xué)信號(hào)放大， 是PCR線性雜交酶顯色法的靈敏度高的主要原因。本研究結(jié)果顯示快速檢測(cè)方法的靈敏度100.0%， 特異度90.0%， 準(zhǔn)確度97.7%， 結(jié)果與李大登等[5]報(bào)道一致。本研究納入為疑似耐藥結(jié)核病患者， 故耐藥陽(yáng)性檢出率為77.27%（68/88）， 遠(yuǎn)高于其他報(bào)道的總耐藥率29.14%[6]， 符合事實(shí)。此外， 與比例法藥敏試驗(yàn)相比， PCR線性雜交酶顯色法成本更低， 更利于在地市級(jí)結(jié)核病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[7]。另外本研究中PCR線性雜交酶顯色法整個(gè)操作過程≤6 h， 可做到當(dāng)天送檢當(dāng)天出結(jié)果， 符合快速檢測(cè)的要求。

綜上所述， 采用PCR線性雜交酶顯色法建立利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)， 與比例法藥敏試驗(yàn)一致性好， 可信度高， 值得臨床推廣。

參考文獻(xiàn)

[1] 歐維正， 駱科文， 王燕， 等.基因芯片與比例法藥敏性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分支桿菌對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的比較研究.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2013， 28（5）：404-407.

[2] 王峰， 崔運(yùn)勇， 胡思玉， 等.實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)熔解曲線法快速檢測(cè)耐多藥結(jié)核分支桿菌.中華結(jié)核和呼吸雜志， 2011， 34（12）：888-893.

[3] 賴國(guó)旗， 張文露， 胡源， 等.反向線性探針雜交技術(shù)檢測(cè)慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥研究.西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2012， 37（3）：113-119.

[4] 范齊文， 吳文娟.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù).微生物與感染， 2012， 7（3）：190-196.

[5] 李大登， 馬俊， 魏小妹. PCR-線性雜交酶顯色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性效果分析.山東醫(yī)藥， 2015， 55（18）：75-76.

[6] 多麗娜， 王婷婷， 宋興勃， 等.分子線性探針技術(shù)分析四川地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥情況.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 31（5）： 822-824.

[7] 李強(qiáng)， 夏輝， 歐喜超， 等.應(yīng)用線性探針技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)耐藥結(jié)核病的成本比較.中國(guó)防癆雜志， 2013， 35（3）：187-190.

[收稿日期：2015-11-09]