范寰　王建國　孟繁瑞　李秀麗　任衛(wèi)科　池晶晶　李富強(qiáng)　田向?qū)W　鄭成江　王文杰

摘 要：以植物乳桿菌為發(fā)酵菌株，研究其對(duì)預(yù)防雞大腸桿菌病中藥組方不同發(fā)酵工藝的臨床藥效的影響。結(jié)果表明，中藥配方經(jīng)完全發(fā)酵后不能抵抗大腸桿菌WW1對(duì)雛雞的攻擊，而植物乳桿菌發(fā)酵陳皮后的中藥組方對(duì)感染大腸桿菌的雛雞的保護(hù)率達(dá)到75%～93.75%，并且低劑量組優(yōu)于中、高劑量組，每日給藥劑量應(yīng)不超過1 g·kg-1 bw。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌；雞大腸桿菌病；發(fā)酵；中藥

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.012

Influence of Different Fermentation Method on Pesticide Effect of Traditional Chinese Medicine against Chicken Colibacillosis

FAN Huan，WANG Jian-guo，MENG Fan-rui，LI Xiu-li，REN Wei-ke，CHI Jing-jing，LI Fu-qiang，TIAN Xiang-xue，ZHENG Cheng-jiang，WANG Wen-jie

（Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research，Tianjin 300384， China）

Abstract：In order to investigate the influence of different fermentation method on pesticide effect of traditional Chinese medicine against chicken colibacillosis， Lactobacillus plantarum strains was used for fermentation. The results show that traditional Chinese medicine after fully fermented cannot protect the chicken against the attack of Escherichia coli WW1. The protection rate of traditional Chinese medicine after Pericarpium citri reticulatae fermented reached 75%～ 93.75%，and the low dose group was better than that of the medium and the high dose group. So the daily dose should be no more than 1 g·kg-1 bw.

Key words：Lactobacillus plantarum； chicken colibacillosis；fermentation；traditional Chinese medicine

微生物發(fā)酵應(yīng)用于中藥炮制工藝中在我國已有千余年的歷史。現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)是以傳統(tǒng)的中藥炮制發(fā)酵法為基礎(chǔ)，利用微生態(tài)學(xué)的特殊性，并結(jié)合酶學(xué)工程所產(chǎn)生的一種中藥高科技制藥新工藝，在中藥發(fā)酵過程中微生物發(fā)揮了強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力，產(chǎn)生了多種次生代謝產(chǎn)物，較大幅度地改變了藥性，能降低毒副作用[1]，提高療效，產(chǎn)生新藥效，利于吸收、改善適口性[2]。

大量的研究表明，發(fā)酵中藥應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)具有“高效、量少、安全”等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)[3]。劉春輝[4]對(duì)復(fù)方中藥進(jìn)行發(fā)酵，通過比較發(fā)酵前后的中藥對(duì)奶牛乳房炎及生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的復(fù)方中藥在降低奶牛乳房炎的發(fā)病率、增加產(chǎn)奶量和改善牛奶品質(zhì)等方面均好于未發(fā)酵的復(fù)方中藥制劑。韓戰(zhàn)強(qiáng)等[5]的研究表明，發(fā)酵中藥在提高母豬泌乳力、健康程度、仔豬生長速度、成活率、降低仔豬腹瀉率等方面與對(duì)照組相比效果均顯著提高。劉觀忠等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，無論是對(duì)肉仔雞的生產(chǎn)性能還是對(duì)血液生化指標(biāo)的影響，發(fā)酵中藥組的使用效果均優(yōu)于中藥組。目前，對(duì)中藥發(fā)酵的研究已從單味藥發(fā)展到了組方藥[7]。韓春楊等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，中藥發(fā)酵制劑組對(duì)肉雞抗新城疫病毒的抗體效價(jià)、免疫器官指數(shù)和飼料利用率等指標(biāo)均高于對(duì)照組，差異顯著（P<0.05）。

本研究選取對(duì)肉雞有益生作用的植物乳桿菌[9]，研究其對(duì)預(yù)防雞大腸桿菌病中藥組方不同發(fā)酵工藝的臨床藥效的影響，為益生菌發(fā)酵中藥替代抗生素提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 受試菌株 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），天津市畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 預(yù)防雞大腸桿菌病的中藥組方 地錦草150 g、黃芩100 g、苦參100 g、蒼術(shù)100 g、陳皮50 g。

1.1.3 受試動(dòng)物 1日齡海藍(lán)褐雛雞180只，公母各半。飼養(yǎng)至7日齡，選擇144只（公母各半）作為試驗(yàn)用雞。將144只雞平均分為9組，每組16只為1籠，公母各半。

1.1.4 發(fā)病菌株 雞致病性大腸桿菌WW1，由天津市畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存。

1.2 方 法

1.2.1 預(yù)防雞大腸桿菌病的全中藥組方發(fā)酵 在含有MRS培養(yǎng)基的組方1中（含水量75%）添加10%活化好的植物乳桿菌（2.3×109 cfu·mL-1），38 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 預(yù)防雞大腸桿菌病中藥組方中陳皮的發(fā)酵 在初始pH值為8的MRS培養(yǎng)基中添加80 g· mL-1的陳皮，接種1%（V/V）活化好的植物乳桿菌（2.3×109 cfu·mL-1）35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間30 h。

1.2.3 雞大腸桿菌病人工模型的建立 在雛雞8日齡時(shí)，每只雛雞胸肌注射大腸桿菌培養(yǎng)液0.2 mL（8×109個(gè)菌·mL-1）。攻菌4 h后，大部分雛雞出現(xiàn)沉郁、嗜臥、飲食減退，活動(dòng)減少。隨后陸續(xù)出現(xiàn)水樣便，昏睡，飲食減少或廢絕。24 h后開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡。

1.2.4 臨床藥效試驗(yàn) 試驗(yàn)藥物準(zhǔn)備工作包括（1）全中藥組方發(fā)酵物顆粒。將發(fā)酵藥物與小麥粉以1/1的比例混合再加適量水制細(xì)粒，顆粒以等量玉米粉包裹，晾干成含生藥25%的顆粒1 000 g備用。（2）全中藥組方發(fā)酵物提取液。取制備好的顆粒400 g，加8倍量水，小火提取2次，每次15 min。合并提取液，過濾，濃縮至50%濃度（即含生藥0.5 g·mL-1）。共制備200 mL，備用。（3）陳皮發(fā)酵后的中藥組方顆粒。將方中陳皮粉碎，過孔徑0.25 mm的篩，加入乳酸菌發(fā)酵（接種量20%，初始pH值自然，陳皮使用量8%，發(fā)酵時(shí)間36 h，溫度35 ℃）。其余未發(fā)酵部分粉碎過孔徑0.25 mm的篩，同發(fā)酵藥物混合，并以中藥∶小麥粉=1∶1的比例加入小麥粉，再加適量水和成團(tuán)狀，制細(xì)粒，再將制成的顆粒以等量玉米粉包裹制粒，成含生藥25%的顆粒。共制成樣品1 000 g，備用。（4）陳皮發(fā)酵后的中藥組方提取液。取制備好的顆粒400 g，加8倍量水，小火提取2次，每次15 min。合并提取液，過濾，濃縮至50%濃度（即含生藥0.5 g·mL-1）。共制備200 mL，備用。（5）全組方中藥顆粒。將處方中各味藥混合，粉碎，過孔徑0.25 mm的篩，加等量小麥粉，制細(xì)粒；再將細(xì)粒以等量玉米粉包裹制粒，成含生藥25%的顆粒，備用。（6） 全組方中藥提取液。另取粉碎后的藥物適量，水煎提取2次，每次15 min。過濾，濃縮至50%（即含生藥0.5 g·mL-1），備用。（7） 對(duì)照藥物鹽酸環(huán)丙沙星顆粒。將鹽酸環(huán)丙沙星片壓碎、研細(xì)，加小麥粉，制成含量為4 mg·g-1的顆粒，共制備100 g，備用。（8） 對(duì)照藥物鹽酸環(huán)丙沙星溶液。另取鹽酸環(huán)丙沙星1片（含鹽酸環(huán)丙沙星250 mg），加蒸餾水50 mL，溶解，成5 mg·mL-1的溶液，備用。

全組方發(fā)酵的臨床試驗(yàn)的藥物劑量設(shè)置及給藥方法。（1）發(fā)病前給藥。如表1所示，設(shè)全中藥組方發(fā)酵顆粒高、中、低3個(gè)劑量組，在攻菌前3 d給藥，按每天0.6 g·只-1、0.4 g·只-1和0.2 g·只-1劑量，分2次給藥。中藥組方顆粒同樣設(shè)置作為對(duì)比。對(duì)照藥物鹽酸環(huán)丙沙星顆粒給藥劑量為每天每只雞0.25 g，分2次給藥。（2）發(fā)病后給藥。如表2所示，攻菌4 h后，各組雞開始發(fā)病時(shí)，改用飲水給藥。給藥劑量為，全中藥組方發(fā)酵物提取液高中低劑量組分別為每天0.3 mL·只-1、0.2 mL·只-1和0.1 mL·只-1，分2次給藥。中藥組方提取液高中低劑量組給藥劑量同上。鹽酸環(huán)丙沙星溶液給藥劑量為每天0.1 mL·只-1，連用3 d。

組方中陳皮發(fā)酵后的臨床試驗(yàn)的藥物劑量設(shè)置及給藥方法。（1）發(fā)病前給藥。如表3所示，設(shè)組方中陳皮發(fā)酵后組方中藥顆粒高、中、低3個(gè)劑量組，在攻菌前3 d給藥，按每天0.6 g·只-1、0.4 g·只-1和0.2 g·只-1劑量，分2次給藥。中藥組方顆粒同樣設(shè)置作為對(duì)比。對(duì)照藥物鹽酸環(huán)丙沙星顆粒給藥劑量為每天每只雞0.25 g，分2次給藥。（4）發(fā)病后給藥。如表4所示，攻菌4 h后，各組雞開始發(fā)病時(shí)，改用飲水給藥。給藥劑量為，組方中陳皮發(fā)酵后中藥組方提取液高中低劑量組分別為每天0.3 mL·只-1、0.2 mL·只-1和0.1 mL·只-1，分2次給藥。中藥組方提取液高中低劑量組給藥劑量同上。鹽酸環(huán)丙沙星溶液給藥劑量為每天0.1 mL·只-1，連用3 d。

1.2.5 療效判定指標(biāo) 因使用的致病性大腸肝菌WW1對(duì)雛雞具有較高致死率，因此以致死率為指標(biāo)評(píng)價(jià)藥物的療效較為簡便直觀。

2 結(jié)果與分析

2.1 全組方發(fā)酵中藥對(duì)感染雛雞的保護(hù)效果

如表5所示，雛雞發(fā)病給藥后，全組方發(fā)酵中藥3個(gè)劑量組最終死亡數(shù)均高于對(duì)應(yīng)的未發(fā)酵中藥劑量組，相當(dāng)于發(fā)病未給藥的攻菌對(duì)照雛雞死亡數(shù)，并且其死亡高峰出現(xiàn)在24 h內(nèi)，明顯較其他組嚴(yán)重。分析原因，可能是發(fā)酵后某些藥物發(fā)生了量或質(zhì)的變化，使得藥物對(duì)發(fā)病雞的死亡起到了加速作用。

未發(fā)酵中藥組3個(gè)劑量雞的死亡數(shù)均低于攻菌對(duì)照組，表明中藥方大腸桿菌病具有較好的治療作用。

2.2 陳皮發(fā)酵后的中藥組方對(duì)感染雛雞的保護(hù)效果

如表6所示，陳皮發(fā)酵后的中藥組方高劑量組、陳皮發(fā)酵后的中藥組方中劑量組、陳皮發(fā)酵后的中藥組方低劑量組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)照組、攻菌對(duì)照組和空白對(duì)照組雛雞保護(hù)率分別為75.00%，75.00%，93.75%，68.75%，68.75%，75.00%，75.00%，56.25%，100.00%，各給藥組與模型對(duì)照組比較，差異顯著（P<0.05）。陳皮發(fā)酵后的中藥組方與組方中藥對(duì)雞大腸桿菌病人工模型均有較好的治療作用。其中陳皮發(fā)酵后的中藥組方低劑量組作用最好，可作為臨床推薦劑量。

從藥物的作用方式來看（表6），陳皮發(fā)酵后的中藥組方顆粒有較好的減輕發(fā)病、減少死亡的作用。可能是陳皮發(fā)酵產(chǎn)生的某些因子可抵抗大腸桿菌的感染和危害，使雛雞發(fā)病癥狀輕、死亡率大大減少。從陳皮發(fā)酵后的中藥組方3個(gè)劑量的數(shù)據(jù)分析，低劑量優(yōu)于中劑量和高劑量，經(jīng)計(jì)算顆粒高劑量、中劑量和低劑量組按體重計(jì)算分別為2.73，1.82，0.9 g·kg-1 bw，顯然高中劑量組高于常用劑量范圍0.2～1 g。處方中苦寒之品較多，過量給藥反而可能會(huì)造成療效的降低。因此，在臨床使用時(shí)，每日給藥劑量應(yīng)不超過1 g·kg-1 bw為宜。

3 結(jié)論與討論

地錦苦芩中藥配方經(jīng)完全發(fā)酵后不能抵抗大腸桿菌WW1對(duì)雛雞的攻擊，因此在預(yù)防雞致病性大腸桿菌病中不適宜使用全方發(fā)酵的中藥配方。植物乳桿菌發(fā)酵陳皮后的中藥組方對(duì)感染大腸桿菌的雛雞具有顯著的保護(hù)作用，并且低劑量優(yōu)于中、高劑量，每日給藥劑量應(yīng)不超過1 g·kg-1 bw。

益生菌作為對(duì)畜禽健康有利的活微生物，通過發(fā)酵對(duì)中藥的生物轉(zhuǎn)化作用巨大，它可以對(duì)單一中藥有效成分或單味中藥全成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，改變單味中藥有效成分的含量和生物活性，改變中藥提取物和中藥復(fù)方生物活性[10]。陳雷等[11]研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵中藥在防治雞球蟲病中有很好的效果。

大量研究表明，發(fā)酵菌在特殊的中藥基質(zhì)中也有可能產(chǎn)生新的代謝過程，因?yàn)橹兴幹杏行┏煞謱?duì)微生物的生長代謝可能有促進(jìn)或抑制作用，從而改變其代謝途徑，產(chǎn)生新的藥物成分；有些發(fā)酵中藥利用的微生物本身就是非常好的藥物，比如雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、糞鏈球菌等，他們本身就是一種益生菌，在動(dòng)物機(jī)體腸道內(nèi)可以產(chǎn)生消化酶、酸類，能夠與病源微生物產(chǎn)生競(jìng)爭性抑制作用，從而產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物有保健作用的物質(zhì)，若再和其他一些藥物作用后就可能達(dá)到良好的治療效果，產(chǎn)生集中藥、酶制劑、益生素于一體的產(chǎn)物了[12]。

中藥發(fā)酵在畜牧業(yè)中的研究和應(yīng)用，無論是基礎(chǔ)理論方面還是研究手段都仍處在起步階段，特別是對(duì)中藥復(fù)方的發(fā)酵研發(fā)還很少，批量生產(chǎn)的發(fā)酵新藥不多?，F(xiàn)代發(fā)酵工藝面臨一些關(guān)鍵性的問題，例如：中藥自身體系的不明確性、中藥所含成分的復(fù)雜性、中藥發(fā)酵機(jī)理的研究還不深入、微生物生長特性的多樣性與在中藥發(fā)酵過程產(chǎn)生生物轉(zhuǎn)化作用的不確定性等[13]。因此，現(xiàn)代發(fā)酵工藝技術(shù)還需進(jìn)一步完善。首先是關(guān)于菌種的選育。根據(jù)李國紅等[14]的試驗(yàn)結(jié)果，在經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，部分中藥的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性增加，而部分中藥的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性卻有所降低，如何從自然界中選育、分離并純化新的藥用菌種，怎樣根據(jù)藥材自身特點(diǎn)選擇合適的發(fā)酵菌種等都還有待進(jìn)一步研究。其次關(guān)于多種微生物發(fā)酵工藝的研究應(yīng)用、發(fā)酵中藥如何進(jìn)行篩選。例如王林等[15]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)向靈芝發(fā)酵液中加入黃芩、連翹、金銀花后，樣品生物量明顯降低，而加入麻黃、萊菔子后靈芝的生物量明顯高于對(duì)照組，說明向發(fā)酵液中加入不同中藥及配比對(duì)靈芝生物量的影響差別很大，甚至?xí)憩F(xiàn)截然不同的效果。第三，確定最適發(fā)酵條件與終點(diǎn)，尋找發(fā)酵過程中科學(xué)的觀測(cè)指標(biāo)，建立中藥篩選模型與多維評(píng)價(jià)體系，也是中藥微生態(tài)發(fā)酵的技術(shù)難點(diǎn)之一[16]。中藥微生態(tài)發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥工藝研究的有機(jī)結(jié)合，在新藥、新獸藥開發(fā)與中藥現(xiàn)代化、國際化過程中占有重要地位[17]。微生物發(fā)酵中藥作為抗生素的替代品成為目前研究的熱點(diǎn)，但其仍處于發(fā)展階段，很多方面有待深入研究[18]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王延年，董雪，喬延江，等.中藥發(fā)酵研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010，12（3）：437-441.

[2] 張冬青，揭廣川.現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)在提高中藥藥用效能方面的作用[J].廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，4（1）：34-37.

[3] 徐啟華，曹軍，曾慶文.玉屏風(fēng)散發(fā)酵液對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J].中國中醫(yī)藥科技，2007，14（1）：10-11.

[4] 劉春輝. 固態(tài)發(fā)酵復(fù)方中藥防治奶牛乳房炎的效果及對(duì)生產(chǎn)性能的影響[J]. 中國奶牛，2013（11）：27-30.

[5] 韓戰(zhàn)強(qiáng)，朱金風(fēng)，蔣曉飛.生物發(fā)酵中藥對(duì)圍產(chǎn)期母豬繁殖性能和仔豬健康的影響[J]. 畜禽業(yè)，2014（8）：38-41.

[6] 劉觀忠，安勝英，王風(fēng)霞.發(fā)酵中藥對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能和血液生化指標(biāo)的影響[J].飼料工業(yè)，2011，32（23）：47-50.

[7] 王瑞，白雪，褚秀玲，等. 中藥發(fā)酵技術(shù)及其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用[J]. 聊城大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，27（4）：68-71.

[8] 韓春楊，劉翠艷，牛鐘相.中藥制劑發(fā)酵前后成分的變化及對(duì)肉雞部分免疫指標(biāo)和生長的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（11）：1 223-1 227.

[9] 劉乃芝，陳靜，崔詩法，等.不同濃度植物乳桿菌對(duì)肉雞免疫機(jī)能的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)，2012（4）：59-60.

[10] 劉曉霓，謝立，劉芳，等. 益生菌生物轉(zhuǎn)化中藥研究現(xiàn)狀[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014，25（4）：928-930.

[11] 陳雷，孫合美，林顯華，等. 益生菌發(fā)酵中草藥復(fù)方防治雞球蟲病研究[J]. 飼料博覽，2013（8）：45-48.

[12] 黃葉.試論微生態(tài)中藥制劑開發(fā)意義與實(shí)踐[J].中國藥業(yè)，2012，21（10）：11-14.

[13] 傅超美，冷靜.中藥發(fā)酵的概括與關(guān)鍵技術(shù)[J].中國藥業(yè)，2008，17（15）：1-3.

[14] 李國紅，張克勤，沈月毛.枯草芽孢桿菌對(duì)50種中藥的發(fā)酵及抗菌活性檢測(cè)[J].中藥材，2006，29（2）：154-157.

[15] 王林，王玉紅，章克昌.靈芝中藥發(fā)酵液對(duì)慢性支氣管炎療效的研究[J].中國食用菌，2004，23（5）：39-41.

[16] 張麗霞，高文遠(yuǎn)，王海洋.微生物技術(shù)在中藥炮制中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，2012，37（24）：3 695-3 700.

[17] 汪洋，汪德剛，張世新，等. 中藥微生態(tài)發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展與展望[J].中國動(dòng)物保健，2014，16（9）：22-26.

[18] 劉鋒，韓春楊，劉翠艷，等. 微生物發(fā)酵中藥飼料添加劑的研究進(jìn)展[J].氨基酸和生物資源，2014，36（2）：18-22.