桑國俊，容維中，郭海龍，王 珂，邱忠玉（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所744000）

新型稀釋液TCM199、EG和GL凍存牛精液效果試驗測定

桑國俊，容維中，郭海龍，王 珂，邱忠玉
（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所744000）

［目的］為探討新型稀釋液凍存牛精液效果。［方法］通過對以TCM199為主要稀釋劑，以EG和GL分別為冷凍保護劑的牛細管凍精的活力測定，篩選出了以TCM199、EG和GL為稀釋劑和冷凍保護劑的新型牛細管凍精制作配方。［結(jié)果］表明：以EG為冷凍保護劑時，配方11的活力最高，達到0.55，以GL為冷凍保護劑時，配方11的活力最高，達到0.6。

TCM199；EG；GL；細管凍精；活力

1　背景

近年來的研究表明，在細胞、胚胎冷凍過程中，為了克服低溫對胚胎等微小生命的打擊，減少或消除細胞和組織間冰晶的形成，必須在培養(yǎng)液中添加一定量的抗凍劑［1］。以前使用的主要是二甲基亞砜（DMSO）或甘油（GL，Glycerol）［2］，但是他們均對細胞或胚胎產(chǎn)生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL強，所以現(xiàn)多用GL。乙二醇（EG，Ethylene Glycol）是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型抗凍劑，用EG冷凍時，細胞產(chǎn)生的冰晶更少；同時發(fā)現(xiàn)，EG對細胞的毒副作用較小［3］。本試驗將利用TCM199作為能量和營養(yǎng)素來源，以GL和EG作為冷凍保護劑，多梯度研究T CM199、GL、EG作為稀釋劑和冷凍保護劑保護精子的最優(yōu)劑量，建立新型牛精液稀釋和冷凍保存技術(shù)。

2　材料

種公牛來自寧縣興旺牧業(yè)種牛場和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所牛場。主要設備有人工采精器械、專用保溫箱、吸管、冰箱、冷凍儀等。

3　方法

稀釋液：按照設計配方、用量進行配制。

冷凍液：第一液為低濃度冷凍液，用于牛精液采集后的第一次稀釋；第二液為高濃度冷凍液，用于第二次平衡稀釋。

TCM199按照其說明濃度配制，并用酚紅和06-0028-03NaOH進行PH標定。EG和GL按照設計添加。

本試驗針對以下2種處理實施，即測定以TCM199和GL為稀釋劑和冷凍保護劑時的精子凍存效果、以TCM199和EG為稀釋劑和冷凍保護劑時的精子凍存效果。每個水平測定10次（重復），每次制作100枚細管凍精，從中隨即抽檢10枚，每次抽檢測定均在制凍后24h進行。試驗結(jié)果用spss統(tǒng)計分析。

4　結(jié)果

4.1以TCM199和GL為稀釋劑和冷凍保護劑時的精子凍存效果

4.1.1配方組合 本項測定以TCM199和GL為稀釋劑和冷凍保護劑時的精子凍存效果。其系列配方詳見表1。特點是TCM199梯度增加，GL適度變化，5號配方添加了10%安鈉加。

4.1.2TCM199+GL的配方組合細管凍精解凍效果 細管凍精的凍存和解凍及測定方法同前項目組。解凍效果詳見表2。

測定結(jié)果表明：

①不同濃度TCM199+GL組的凍精解凍活力不同。0～12h活力11、2、3號組高于其它組（P＜0.01），同時，1、4、10號也表現(xiàn)出了較高的活力。

②活力衰減速率不一致?；盍λp比較緩慢的是1、2、3、4、11號，減緩比較快的是5、6、7、8、9、10號。從配方構(gòu)成看，衰減緩慢的組中TCM199和GL的比例低，衰減快的含量高且添加了檸檬酸鈉。11號中TCM199和GL的比例雖然高，但卻表現(xiàn)出了本專題試驗中最好的曲線，這與缺失果糖和檸檬酸鈉有關。

③綜合比較。TCM199本身就是一種復合型營養(yǎng)體，含有細胞生長發(fā)育的多種營養(yǎng)成分。添加過多的其它營養(yǎng)物質(zhì)反而未得到更高的活力表達，如無其它營養(yǎng)素的11號最好，添加了檸檬酸鈉和果糖的最差，未添加檸檬酸鈉的較好。

表2　TCM199+GL的配方組合凍存凍精的解凍效果統(tǒng)計

4.2以TCM199和EG為稀釋劑和冷凍保護劑時的精子凍存效果

4.2.1配方組合 本組試驗了以TCM199稀釋劑和以EG為冷凍保護進行的牛精液冷凍效果試驗。目的是探討TCM199和EG相互作用于精液的效果，其配方詳見表3。

表3　TCM 199+EG的配方組合

本項試驗中，在測定不同濃度TCM199、EG的同時，在平行配方中還添加了卵磷脂、Tris、檸檬酸鈉及果糖。

4.2.2細管凍精解凍效果 細管凍精的凍存和解凍及測定方法同GL組。解凍效果詳見表4。

表4　TCM199+EG的配方組合活力測定統(tǒng)計

測定結(jié)果表明：

①不同濃度TCM199+EG組的凍精解凍活力不同。0～12h階段的活力以2、9、11號組高于其它組（P＜0.01），同時，1、4號活力最低。

②活力衰減速率不一致?；盍λp分為比較明顯的3個階段，其中0～6h為第一階段，其特點是活力下降速度快；6～24h為第二階段，各組的活力均緩慢下降；24～48h為第三階段，活力進一步下降到消失。在這3個起伏階段中，與TCM199+GL試驗相似，依然是單純由TCM199+GL的組如11號的活力好于其它組，其次是未添加檸檬酸鈉的組，活力比較低的是既添加檸檬酸鈉又添加果糖的試驗組。但與TCM199+GL試驗相比，TCM199+EG的各組試驗的活力相對較低。2號配方中添加了卵磷脂，活力也較高。

5　結(jié)果與分析

通過本次對TCM199、EG和GL組及其對比試驗表明：

1）以TCM199+GL為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗是在基礎液果糖和超純水的基礎上，加入了TCM199和GL，同時也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂，但未添加EG。其冷凍精液解凍活力明顯高于未添加TCM199和EG、GL的組和僅添加TCM199的組。測定表明，不同濃度TCM199+GL組的凍精解凍活力不同。活力高且比較穩(wěn)定的是11、2、3號組。

2）以TCM199+EG為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗是在基礎液果糖和超純水的基礎上，加入了TCM199和EG，同時也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷凍精液解凍活力明顯高于未添加TCM199和EG、GL的組和僅添加TCM199的組，但又低于TCM199+ GL組。測定表明，該組2、9、11號的活力最好。

3）綜合分析。通過對2種不同處理及其多樣本資源的測定與分析，對于TCM199+GL和TCM199+EG的2種處理，解凍凍精的質(zhì)量較高，其解凍精子的活力維持時間較長，精子品質(zhì)較高，其中GL組要比EG組效果好，但均可滿足人工授精的需求。推薦配方為TCM199+EG組的配方11；TCM199+GL組的配方2、配方5和配方11。

4）小結(jié)。上述試驗結(jié)果表明，TCM199、EG和GL對牛精子均有良好的冷凍保護能力；其它營養(yǎng)成分的變化對EG和GL保護精子的效果有一定影響，特別是卵黃的作用在營養(yǎng)組份中的作用比較明顯。在同等條件下，GL對精子的冷凍保護效果明顯優(yōu)于EG。

［1］ 鄧福金，王化青，吳慶榮.牛精液冷凍機理的探討［J］.中國牛業(yè)科學，2013，2（39）：57-59.

［2］ 賈永宏，朱慶超，楊海濤等.牛精液冷凍保護劑研究進展［J］.家畜生態(tài)學報，2014，1（35）：5-8.

［3］ 趙家才，毛翔光，馬燕茹等.BMY牛細管冷凍精液生產(chǎn)工藝及稀釋液的篩選［J］.中國牛業(yè)科學，2010，2（36）：19-22.

The Effect Experiment of New Diluents（TCM199、Cryoprotectant EG and GL）on Semen Cryopreservation of Cattle

SANG Guo-jun，RONG Wei-zhong，GUO Hai-long，WANG Ke，QIU Zhong-yu
（Gansu Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Pingliang，Gansu，744000，China

【Objective】The aim of this study was to discuss the effect of new Diluents，such as TCM199，Cryoprotectant EG and GL，on Semen Cryopreservation.【Method】In this experiment TCM199 was taken as diluent，EG and GL were taken as the cryoprotectant to determine the sperm motility of bovine frozen semen and selected the formula.【Result】The experiment results was showed that the best thawing sperm motility were group 11（motility was 0.55）for 12 treaments about diluent TCM199and cryoprotectant EG，and also group 11（motility was 0.60）for 12treaments about diluent TCM199and cryoprotectant GL.

TCM199；ethylene Glycol；glycerol，semen Cryopreservation；sperm motility.

S823.3

A

1001-9111（2015）

2015-06-20 修改日期：2015-06-25

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應用開發(fā)項目“EG和TCM199提高牛精液冷凍效果的關鍵技術(shù)研究”作者簡介：桑國俊（1963-），男，甘肅省臨洮縣人，博士，研究員，主要研究方向為動物遺傳育種與繁殖。