張倩雯，王春霞，楊麗蕓，黃衛(wèi)東，戰(zhàn)吉宬*（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

影響釀酒酵母發(fā)酵過程的因素分析

張倩雯，王春霞，楊麗蕓，黃衛(wèi)東，戰(zhàn)吉宬*
（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

葡萄酒的酒精發(fā)酵主要是由釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）完成的，不同的培養(yǎng)條件會影響釀酒酵母的發(fā)酵效率。該文以模擬葡萄汁代替天然葡萄汁進行試驗，考察環(huán)境溫度、搖床轉(zhuǎn)速以及發(fā)酵基質(zhì)pH對釀酒酵母的影響。試驗結(jié)果顯示，在18～33℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，發(fā)酵效率逐漸增大。28℃是最適宜酵母生長的溫度條件。在50～150 r/min范圍內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)速的增大，酵母的發(fā)酵效率逐漸增加，所需發(fā)酵時間逐漸縮短，以150 r/min為最適轉(zhuǎn)速。在葡萄酒釀造常用的pH范圍內(nèi)，釀酒酵母的生長和發(fā)酵情況隨pH的升高而增強，在pH值為4.0時達到最佳生長和發(fā)酵效率。

釀酒酵母；溫度；轉(zhuǎn)速；pH；發(fā)酵

葡萄酒的釀造主要是微生物代謝及其代謝物轉(zhuǎn)變的過程［1］，葡萄酒的酒精發(fā)酵是由釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）完成的，因此釀酒酵母在葡萄酒的釀造過程中起非常重要的作用。在該過程中，釀酒酵母的行為受到外界培養(yǎng)條件的影響，不同的培養(yǎng)條件會在影響酵母生長的基礎(chǔ)上影響葡萄醪的最終發(fā)酵產(chǎn)物。

目前大多數(shù)實驗室和工業(yè)酵母都在20～30℃的條件下培養(yǎng)［2］，據(jù)報道，釀酒酵母的適宜生長溫度是25～33℃，25～30℃對酵母繁殖比較有利，而30～37℃對酒精的產(chǎn)生有利［3］。因此有必要在25～37℃選取既利于酵母生長繁殖也能使其快速發(fā)酵產(chǎn)生酒精的溫度。在實驗室中，常使用搖床來進行發(fā)酵試驗［1，4-7］。培養(yǎng)釀酒酵母使用搖床的目的之一是排出培養(yǎng)基中酵母生成的CO2，CO2能夠通過影響酵母細(xì)胞內(nèi)外的pH值、細(xì)胞膜及酶來抑制酵母的生長代謝［8］。而轉(zhuǎn)速對釀酒酵母的生長與發(fā)酵狀況也有一定影響［9］。pH值不僅可以作為發(fā)酵產(chǎn)物的指示指標(biāo)，也可以作為發(fā)酵過程的指示指標(biāo)。在葡萄醪的酒精發(fā)酵過程中，酵母將底物成分（糖、有機酸、氮等）轉(zhuǎn)變成為酒精等代謝物的過程的熱力學(xué)平衡都受到pH值的影響［10］。酵母適宜在微酸性的條件下生長，其適應(yīng)pH范圍為3.6～6.0，最適生長范圍為pH 4.5～5.0，而在葡萄酒的釀造過程中，pH一般為3.3～3.5［11］。

雖然目前的研究已經(jīng)得出能夠影響酵母發(fā)酵過程的因素［12-15］，但是這些因素帶來的具體影響比較復(fù)雜［14］。該實驗對溫度、pH值以及搖床轉(zhuǎn)速對釀酒酵母發(fā)酵的影響進行研究，對獲得酵母在發(fā)酵過程中的生物學(xué)性狀，對指導(dǎo)生產(chǎn)以及建立葡萄酒酵母的篩選標(biāo)準(zhǔn)有重要意義［16］。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BH8：由本實驗室分離并保存；商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AWRI R2和Freddo分別購自澳大利亞Marivin公司及德國Erbs1oh公司。本實驗將釀酒酵母AWRI R2、BH8和Freddo重新編號為A、B、F。

1.1.2試驗試劑

氫氧化鈉（NaOH）、濃硫酸及配制培養(yǎng)基中所用試劑均為分析純：北京化學(xué)試劑廠。

1.1.3培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptide dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，121℃滅菌20 min。

模擬葡萄汁（mode1 synthetic medium，MSM）培養(yǎng)基（g/L）：配方參考文獻［17］，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

AUY220分析天平、UV 1800紫外分光光度計；日本SHIMADZU公司；SKY-2102C恒溫培養(yǎng)搖床；上海蘇坤實業(yè)有限公司；pH211臺式酸度計：意大利HANNA公司。

1.3方法

1.3.1釀酒酵母的發(fā)酵培養(yǎng)

取一環(huán)斜面保藏菌種轉(zhuǎn)接到60 mL YPD液體培養(yǎng)基中。用三角瓶在一定溫度、一定轉(zhuǎn)速條件下進行搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期（OD600nm值1.45～1.50）。取4 mL對數(shù)中期的酵母菌懸液至400 mL MSM培養(yǎng)基中，取不同時間的發(fā)酵液測定OD600nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱重瓶用裝有濃硫酸的發(fā)酵栓封口，取樣瓶用裝有無菌水的發(fā)酵栓封口，根據(jù)試驗設(shè)計在相應(yīng)的溫度、轉(zhuǎn)速及pH條件下培養(yǎng)，其中，溫度、轉(zhuǎn)速通過設(shè)置恒溫培養(yǎng)搖床參數(shù)調(diào)節(jié)，培養(yǎng)基質(zhì)pH值通過向培養(yǎng)基中添加NaOH，以酸度計實時測量進行調(diào)節(jié)。

1.3.2釀酒酵母生長曲線的測定

接種前及發(fā)酵過程中每天取發(fā)酵液5 mL，以接種前的MSM培養(yǎng)基為空白對照，在波長600 nm處測定吸光度值OD600nm。

1.3.3釀酒酵母發(fā)酵性能的測定

利用菌株A、B、F在400 mL MSM培養(yǎng)基中相應(yīng)的CO2釋放量，以此表示酵母的發(fā)酵性能。連續(xù)兩天質(zhì)量差值小于0.02 g時認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。采用二氧化碳失重法測定，即發(fā)酵過程中釀酒酵母產(chǎn)生的CO2通過裝有濃硫酸的發(fā)酵栓釋放出去，導(dǎo)致稱重瓶內(nèi)整體質(zhì)量損失，單日稱重瓶整體質(zhì)量損失即代表其當(dāng)日發(fā)酵性能［18］。

1.3.4釀酒酵母培養(yǎng)溫度梯度設(shè)置

A菌株適用于紅葡萄酒的釀造，其最適生長溫度范圍是18～25℃；F菌株適用于白葡萄酒的釀造，在溫度范圍13～17℃時，發(fā)酵表現(xiàn)最好；該試驗設(shè)置溫度梯度為18℃、23℃、26℃、28℃、33℃。設(shè)置恒溫培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，發(fā)酵pH值為4。

1.3.5轉(zhuǎn)速梯度設(shè)置

由多數(shù)參考文獻可知當(dāng)轉(zhuǎn)速大于150 r/min時，不同轉(zhuǎn)速對釀酒酵母的發(fā)酵表現(xiàn)無顯著影響［19］。該試驗設(shè)置轉(zhuǎn)速梯度為0、50 r/min、100 r/min、120 r/min，150 r/min，設(shè)置恒溫培養(yǎng)搖床溫度為28℃，發(fā)酵pH值為4。

1.3.6pH梯度設(shè)置

葡萄酒的釀造過程中，pH常被控制在3.3～4.0之間，通過向MSM培養(yǎng)基中添加NaOH調(diào)節(jié)pH值，設(shè)置用于測量釀酒酵母生長曲線的取樣瓶內(nèi)培養(yǎng)基pH梯度為3.1、3.4、3.7、4.0；另設(shè)置用于測量釀酒酵母發(fā)酵效率的稱重瓶內(nèi)培養(yǎng)基pH梯度為2.8、3.1、3.4、3.7、4.0。設(shè)置恒溫培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度為28℃。

1.3.7數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用SPSS 17.0進行方差分析和顯著性差異分析，顯著水平0.05；采用SigmaP1ot 12.0繪制圖表。

2　結(jié)果與分析

2.1不同溫度對釀酒酵母發(fā)酵過程的影響

2.1.1不同溫度條件下釀酒酵母的生長曲線

OD600nm的大小可以反映出MSM培養(yǎng)基中釀酒酵母細(xì)胞的濃度，對不同培養(yǎng)時間的菌液進行測定，了解菌株A、B、F在不同培養(yǎng)溫度下的基本生長情況。結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同溫度條件下釀酒酵母的生長曲線Fig.1 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiaeunder different temperatures

由圖1可見，培養(yǎng)的溫度條件不同導(dǎo)致酵母的生長狀況也不同。發(fā)酵所需時間隨溫度的升高而遞減；酵母在對數(shù)生長期時的生長速度在18～33℃范圍內(nèi)隨溫度的升高而遞增，33℃條件下酵母在第3天即從對數(shù)生長期進入穩(wěn)定期，23℃、26℃、28℃溫度條件下酵母生長均在第4天進入穩(wěn)定期，而18℃溫度條件下的酵母生長則在第6天才進入穩(wěn)定期，并且生長的延滯期相對于其他溫度延長了一天。溫度設(shè)置為23℃、26℃、28℃的培養(yǎng)基中釀酒酵母所能達到的生物量較高，18℃培養(yǎng)的酵母生長進入穩(wěn)定期之后酵母生物量仍在緩慢上升，逐漸接近23～28℃溫度條件下酵母進入穩(wěn)定期后的生物量，而33℃條件下培養(yǎng)的酵母生長迅速，最早進入穩(wěn)定期，但所能達到的生物量較低。28℃條件下培養(yǎng)的酵母前期的生物量增長僅次于33℃，酵母生長速度高于26℃條件下生長速度。不同菌株的釀酒酵母生物量達到最大的溫度條件不同，菌株A、F的在26℃發(fā)酵的第6天達到，OD600nm值分別為2.310和2.314；而菌株B的最大生物量在28℃發(fā)酵的第6天達到，OD600nm值為2.288。

2.1.2不同溫度條件下釀酒酵母的發(fā)酵效率

圖2　不同溫度條件下釀酒酵母發(fā)酵過程中的單日質(zhì)量損失Fig.2 Daily mass loss ofS.cerevisiaeunder different temperatures conditions

圖2為不同溫度條件下A、B、F三株釀酒酵母發(fā)酵過程中的單日質(zhì)量損失結(jié)果。根據(jù)圖2的趨勢可以看出，單日質(zhì)量損失都隨著發(fā)酵時間的延長而先升高后降低。33℃條件下在發(fā)酵的第1天，各菌株的質(zhì)量損失都明顯高于其他溫度組，分別是28℃發(fā)酵第1天質(zhì)量損失的166%（A）、187%（B）、189%（F）。不同溫度條件下達到最大單日質(zhì)量損失所需時間不同，發(fā)酵溫度為26℃、28℃、33℃時在第2天質(zhì)量損失最大，分別為10.97～12.27 g、12.14～13.29 g、10.96～12.84 g。而23℃時在第3天質(zhì)量損失最大，為8.74～9.72 g。在18℃溫度條件下，在第4天質(zhì)量損失最大，為6.23～6.56g。其中28℃發(fā)酵的最大單日質(zhì)量損失為所有溫度梯度中最高，其次依次為33℃、26℃、23℃、18℃。隨著溫度的降低，發(fā)酵所需時間延長，中后期的單日質(zhì)量減少趨勢也變得緩慢。當(dāng)發(fā)酵過程中單日質(zhì)量損失小于0.1 g后，發(fā)酵仍將持續(xù)6 d左右。

根據(jù)試驗所得數(shù)據(jù)分析可知，在不同溫度條件下，各菌株單日質(zhì)量損失有顯著性差異（P＜0.05），因此，溫度對酵母的發(fā)酵過程有顯著影響。綜合而言，28℃是A、B和F 3株酵母的最適發(fā)酵溫度，該結(jié)果與YALCIN S K等［3］的試驗結(jié)果吻合，此外，3株酵母的發(fā)酵能力大小為B＞F＞A。在該溫度下，酵母在對數(shù)期的生長較快，需要較短的時間即可進入生長的穩(wěn)定期，并能達到比較高的生物量水平；單日質(zhì)量損失大即發(fā)酵速度快。培養(yǎng)溫度的降低會延長酵母的延滯期，減慢發(fā)酵速度，使釀酒酵母雖然同樣可以達到較高的生物量［13］，但是該過程需要較長的時間。其原因可能是低溫影響了酵母中酶的活性，糖的轉(zhuǎn)運速度下降［5］。釀酒酵母對酒精的敏感性隨溫度的升高而增強［15］，這可能是由于培養(yǎng)溫度升高導(dǎo)致發(fā)酵不完全。在經(jīng)過一段時間的發(fā)酵后，培養(yǎng)液中已經(jīng)積累了較高濃度的酒精，由于酵母在高溫下受到酒精的脅迫較強而停止發(fā)酵。

2.2不同轉(zhuǎn)速對釀酒酵母發(fā)酵過程的影響

2.2.1不同轉(zhuǎn)速條件下釀酒酵母的生長曲線

菌株A、B、F在不同轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)的基本生長情況見圖3。

由圖3可以看出，在所設(shè)置的轉(zhuǎn)速梯度條件中，酵母生長進入穩(wěn)定期的時間相對一致，均為第4天；轉(zhuǎn)速從0至150 r/min范圍內(nèi)隨轉(zhuǎn)速的增大，達到的最大酵母細(xì)胞濃度逐漸上升，在0～100 r/min的范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速每提高50 r/min 的OD600nm值升高0.3左右；釀酒酵母菌株A、B、F在150 r/min條件下酵母最大生長量對應(yīng)的OD600nm值分別為2.238、2.259、2.290，與120 r/min的數(shù)據(jù)差異不大，二者的生長曲線相關(guān)性檢驗結(jié)果為無顯著性差異（P＞0.05）。菌株A的最大生長量發(fā)生在150 r/min，而菌株B和F的最大生長量發(fā)生在120 r/min。在大于50 r/min的條件下，隨轉(zhuǎn)速的增大，發(fā)酵所耗時間變短。

圖3　不同轉(zhuǎn)速條件下釀酒酵母的生長曲線Fig.3 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiaeunder different shaking speeds conditions

2.2.2不同轉(zhuǎn)速條件下釀酒酵母的發(fā)酵效率

圖4　不同轉(zhuǎn)速條件下釀酒酵母發(fā)酵過程中的單日質(zhì)量損失Fig.4 Daily mass loss ofSaccharomyces cerevisiaeunder different shaking speeds conditions

圖4為不同轉(zhuǎn)速條件下，菌株A、B、F在MSM培養(yǎng)基中相應(yīng)的CO2釋放量。由圖4可以看出，酵母單日質(zhì)量損失隨著發(fā)酵時間的延長先迅速升高后緩慢降低。150 r/min和120 r/min條件下的最大單日質(zhì)量損失均發(fā)生在第3天，且質(zhì)量損失相當(dāng)，分別為12.53～13.32 g、12.14～13.29 g；其次為100 r/min條件下最大單日質(zhì)量損失發(fā)生在發(fā)酵第3天，為9.98～11.75 g；50 r/min條件下最大單日質(zhì)量損失5.37～6.01 g和0轉(zhuǎn)速條件下質(zhì)量損失4.58～5.01 g，分別發(fā)生在發(fā)酵第3天和發(fā)酵第4天。此外，轉(zhuǎn)速在150 r/min條件下發(fā)酵所需時間最短；隨轉(zhuǎn)速降低，發(fā)酵所需時間逐漸延長。

搖床能夠加速發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2的排出，并能夠使酵母懸浮在培養(yǎng)液中，在一定程度上增加菌液濃度。低轉(zhuǎn)速情況下釀酒酵母的生長和發(fā)酵情況較差可能由于CO2未能及時排除，脅迫釀酒酵母，影響到其生長和發(fā)酵來解釋［8］。可以得出在150 r/min條件下，A、B、F 3株酵母的生長狀況良好且發(fā)酵效率最高。

2.3不同pH值對釀酒酵母發(fā)酵過程的影響

2.3.1不同pH值條件下釀酒酵母的生長曲線

菌株A、B、F在不同pH值培養(yǎng)條件下的基本生長情況見圖5。

圖5　不同pH條件下釀酒酵母的生長曲線Fig.5 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiaeunder different pH conditions

由圖5可知，3株釀酒酵母在不同pH值條件下，均在第2天就進入生長穩(wěn)定期，生物量在第6天達到最高，OD600nm值約為2.5。經(jīng)過對數(shù)據(jù)分析可知，在不同的pH條件下進行的發(fā)酵，各菌株在不同pH值條件下所測得的值無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.2不同pH條件下釀酒酵母的發(fā)酵效率

圖6　不同pH條件下釀酒酵母發(fā)酵過程中的單日質(zhì)量損失Fig.6 Daily mass loss ofSaccharomyces cerevisiaeunder different pH conditions

圖6為不同pH條件下，菌株A、B、F在MSM培養(yǎng)基中相應(yīng)的CO2釋放量。由圖6可以看出，不同pH條件下釀酒酵母的發(fā)酵速度和單日最大質(zhì)量損失隨pH的降低而降低，但不同pH條件下的單日最大質(zhì)量損失差異較小。pH值為4.0時，釀酒酵母發(fā)酵最快，在第8天的單日質(zhì)量損失即＜0.1 g。低pH對不同菌株的影響大小不同，A和F菌株受到的影響較大，B菌株受到的影響較小。經(jīng)過對數(shù)據(jù)分析可知，3株菌在pH為4.0時，單日質(zhì)量損失與pH值為3.1、3.4時相應(yīng)菌株的單日質(zhì)量損失有顯著性差異（P＜0.05），說明pH值為4.0時，A、B、F釀酒酵母發(fā)酵速度明顯快于pH值3.1、3.4條件下相應(yīng)酵母的發(fā)酵速度。

在釀酒酵母的發(fā)酵過程中，隨pH值的降低，酵母的生長與發(fā)酵情況也逐漸變差，這可能是由釀酒酵母在低pH下的繁殖能力下降［20］和釀酒酵母在較低的pH條件下對CO2的耐受性下降導(dǎo)致的［8，21］。由試驗結(jié)果可以看出，pH值在4.0的情況下，酵母的生長和發(fā)酵情況最好。

3　結(jié)論

本實驗主要研究了在不同的溫度、轉(zhuǎn)速以及pH條件下釀酒酵母（S.cerevisiae）在模擬葡萄汁培養(yǎng)基中的生長和發(fā)酵過程。試驗結(jié)果顯示，在18～33℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，發(fā)酵效率逐漸增大，28℃是最適宜酵母生長的溫度。在50～150 r/min的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)速的增大，酵母的發(fā)酵效率逐漸增大，所需發(fā)酵時間也逐漸縮短，在150 r/min的轉(zhuǎn)速條件下，3株酵母生長狀況良好且發(fā)酵效率最高。在葡萄酒釀造常用的pH范圍內(nèi)（3.3～4.0），釀酒酵母的生長和發(fā)酵情況隨pH的升高而增強，pH值在4.0的情況下，酵母的生長和發(fā)酵情況最好。而在本試驗中，B菌株受到低pH的影響較小，說明B菌株對低pH條件有一定耐性。本試驗作為研究釀酒酵母其他更深入的方面研究的基礎(chǔ)，為在葡萄酒釀造相關(guān)試驗選擇條件中提供了的理論依據(jù)。

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Research on the factors affectingSaccharomyces cerevisiaefermentation

ZHANG Qianwen，WANG Chunxia，YANG Liyun，HUANG Weidong，ZHAN Jicheng*
（Co11ege of Food Science and Nutritiona1 Engineering，China Agricu1tura1 University，Beijing 100083，China）

The ethano1 fermentation of wine is main1y comp1eted bySaccharomyces cerevisiae.Different cu1ture condition can inf1uence the fermentation efficiency ofS.cerevisiae.In this study，mode1 synthetic medium was used to rep1ace the grape must.The effect of temperature，shaking speed and pH of the medium onS.cerevisiaewas studied.The resu1ts showed that in the 18-33℃temperature range，the fermentation effcieng rose up with the increase of temperature 28℃was the most suitab1e temperature for the growth ofS.cerevisiae.Whi1e in the 50-150 r/min speed range，fermentation efficiency rose up and the period of fermentation shortened with the increase of shaking speed.The 150 r/min was the optima1 shaking speed for S.cerevisiaeto reproduce and ferment.Moreover，in the pH range which was wide1y used in wine making，the growth ofS.cerevisiaeand its fermentation condition increased with the increase of pH，and pH 4 was the optima1 cu1ture condition forS.cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae；temperature；shaking speed；pH；fermentation

TS210.9

A

0254-5071（2015）12-0014-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.004

2015-10-29

國家星火計劃項目（2015GA600003）

張倩雯（1991-），女，碩士研究生，研究方向為葡萄與葡萄酒相關(guān)微生物。

戰(zhàn)吉宬（1972-），男，副教授，博士，研究方向為葡萄栽培與釀造研究。