王廣慧 魏雅冬 于德涵

摘要：為了研究采用復(fù)合酶法從金針菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing]中提取總黃酮的最適條件，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探討了料液比、酶反應(yīng)時(shí)間、酶反應(yīng)溫度、酶反應(yīng)pH對(duì)金針菇總黃酮提取率的影響，并以金針菇總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，復(fù)合酶法提取金針菇總黃酮的最適條件為料液比1∶20（g∶mL），酶反應(yīng)時(shí)間80 min，酶反應(yīng)溫度60 ℃，酶反應(yīng)pH 5，在此條件下金針菇總黃酮的提取率為4.76%。

關(guān)鍵詞：復(fù)合酶法；金針菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing]；總黃酮；提取

中圖分類號(hào)：S646.1+5；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）14-3482-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.038

Optimization of Complex Enzymatic Extraction of Flavone From

Flammulina velutiper （Fr.） Sing

WANG Guang-hui，WEI Ya-dong，YU De-han

（Department of Pharmacy Chenical Engineering， Suihua University， Suihua 152061， Heilongjiang， China）

Abstract： In this paper， the optimal conditions of complex enzymatic extraction of flavone from Flammulina velutiper （Fr.） Sing were studied. Through the single factor and orthogonal experiments， the influences of solid-liquid ratio， enzymatic reaction time， enzymatic reaction temperature and enzymatic reaction pH on the extraction rate of flavone were discussed， and the extraction process was optimized. The experimental results showed that the optimum conditions were as follows： the solid-liquid ratio of 1：20（g/mL）， enzymatic reaction time of 80 min， enzymatic reaction temperature of 60 ℃ ， enzymatic reaction pH of 5. Under this condition， flavone extraction rate was 4.76%.

Key words： complex enzyme； Flammulina velutiper （Fr.） Sing； total flavone； extraction

金針菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing]學(xué)名毛柄金錢菌，屬擔(dān)子菌綱傘菌目白蘑科金錢菌屬。現(xiàn)代藥理研究表明，金針菇含有多種有效藥用成分，尤其是黃酮類化合物具有消炎、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等多種生物活性[1-5]。因此，金針菇總黃酮具有廣闊的開發(fā)前景，建立高效經(jīng)濟(jì)的金針菇總黃酮提取方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用復(fù)合酶法提取金針菇總黃酮，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)金針菇總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為合理開發(fā)金針菇總黃酮資源開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇，綏化學(xué)院食用菌研究所提供；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭Ｄ竟系鞍酌福?0 000 U/g）和纖維素蛋白酶（10 000 U/g）購于上海信帆生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋、FW100型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；TDL-60B-B型臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；JY501型電子分析天平：上海衡平儀器儀表廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取在105 ℃下常壓干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 5.0 mg，添加 70%乙醇定容至50 mL搖勻，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.10 mg/mL）。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中，分別加入 5%亞硝酸鈉溶液 0.30 mL搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用70%乙醇稀釋至刻度搖勻，靜置10～15 min，以不加蘆丁為空白對(duì)照，于 510 nm 處測吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 金針菇中總黃酮的測定方法 將所測得的金針菇總黃酮提取液的吸光度（測定方法同“1.3.1”）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出總黃酮濃度C（mg/mL），則可計(jì)算總黃酮提取率為：

總黃酮提取率=C×上清液體積×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量×100%

1.3.3 復(fù)合酶法提取金針菇總黃酮的方法 金針菇經(jīng)除雜、50 ℃烘箱干燥以及利用高速萬能粉碎機(jī)粉碎（粉碎后過80目篩）等預(yù)處理后，得到金針菇子實(shí)體干粉。準(zhǔn)確稱取金針菇粉若干份，每份3.0 g，放入燒杯中按一定比例加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液及樣品量1.5%的復(fù)合酶（木瓜蛋白酶和纖維素酶按質(zhì)量比1∶1混合），酶解一段時(shí)間后80 ℃滅酶10 min。提取后離心，取上清液。將上清液用70 ℃水浴適當(dāng)濃縮后與95%乙醇按1∶3混合，置于4 ℃下醇沉12 h， 以除去多糖等雜質(zhì)。然后3 500 r/min離心10 min。準(zhǔn)確吸取上清液1 mL于10.00 mL 容量瓶中，后面的測定方法如“1.3.2”所述，計(jì)算出提取液中的總黃酮濃度及總黃酮提取率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1）料液比。準(zhǔn)確稱取金針菇粉5份，每份3.0 g。將每份金針菇粉中再加入樣品量1.5%的復(fù)合酶，酶解溫度50 ℃，酶解pH 5，反應(yīng)時(shí)間80 min，分別設(shè)置料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL，下同）的條件下提取總黃酮，測定總黃酮提取率。

2）酶反應(yīng)時(shí)間。將每份金針菇粉按最佳料液比加緩沖液， 添加酶量為樣品量的1.5%，在酶解溫度50 ℃，酶解pH 5的條件下，調(diào)節(jié)酶反應(yīng)時(shí)間，分別在50、60、70、80、90 min時(shí)提取總黃酮，測定總黃酮提取率。

3）酶反應(yīng)溫度。將每份金針菇粉按最佳料液比加緩沖液，按樣品量的1.5%加入復(fù)合酶，在最適酶解時(shí)間，酶解pH 5的條件下，調(diào)節(jié)復(fù)合酶反應(yīng)溫度，分別在30、40、50、60、70 ℃時(shí)提取總黃酮，測定總黃酮提取率。

4）酶反應(yīng)pH。將每份金針菇粉按最佳料液比加緩沖液，按樣品量的1.5%加入復(fù)合酶，在最適酶解溫度、最適酶解時(shí)間的條件下，調(diào)節(jié)酶反應(yīng)pH，分別在pH 為3、4、5、6、7時(shí)提取總黃酮，測定總黃酮提取率。

1.3.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇對(duì)金針菇總黃酮提取率影響較大的因素和水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定提取金針菇總黃酮的最佳條件。

1.3.6 不同方法的對(duì)比研究

1）乙醇浸提法。乙醇浸提法參照文獻(xiàn)[6]。

2）超聲波輔助乙醇浸提法。對(duì)金針菇按照“1.3.3”的方法進(jìn)行預(yù)處理，得到子實(shí)體干粉。準(zhǔn)確稱取金針菇粉3.0 g，放入燒杯中，按料液比1∶25加入70%乙醇，浸泡30 min后在功率為400 W下超聲波處理6 min，離心取上清液。準(zhǔn)確吸取上清液1 mL于10.00 mL 容量瓶中，測吸光度，計(jì)算出提取液中總黃酮濃度及提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到總黃酮的線性回歸方程為：y=0.375 9x+0.019 6，R2=0.997 9。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比 試驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)不同的料液比，分別是1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，結(jié)果見圖2。由圖2可知，料液比為1∶20時(shí)金針菇總黃酮的提取率為4.46%，高于其他的提取率，因而最佳料液比為1∶20。

2.2.2 酶反應(yīng)時(shí)間 將每份金針菇粉按最佳料液比1∶20，在酶解溫度50 ℃，酶解pH 5的條件下，調(diào)節(jié)復(fù)合酶反應(yīng)時(shí)間，分別在50、60、70、80、90 min時(shí)提取總黃酮，結(jié)果見圖3。由圖3可知，酶反應(yīng)時(shí)間80 min時(shí)金針菇總黃酮的提取率為4.46%高于其他水平下的提取率，因而最佳酶反應(yīng)時(shí)間為80 min。

2.2.3 酶反應(yīng)溫度 將每份金針菇粉按最佳料液比1∶20，酶反應(yīng)時(shí)間80 min，酶反應(yīng)pH 5的條件下，調(diào)節(jié)復(fù)合酶反應(yīng)溫度，分別在30、40、50、60、70 ℃時(shí)提取總黃酮，得到的結(jié)果見圖4。由圖4可知，酶反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)金針菇總黃酮的提取率4.46%高于其他水平下的提取率，因而最佳酶反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.2.4 酶反應(yīng)pH 將每份金針菇粉按最佳料液比1∶20，酶反應(yīng)時(shí)間80 min，酶反應(yīng)溫度50 ℃，調(diào)節(jié)酶反應(yīng)pH，分別在3、4、5、6、7時(shí)提取總黃酮，結(jié)果見圖5。由圖5可知，酶反應(yīng)pH 5時(shí)金針菇總黃酮的提取率4.46%，高于其他水平下的提取率，因而最佳酶反應(yīng)pH為5。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇對(duì)金針菇總黃酮提取率影響較大的因素和水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以金針菇總黃酮提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素與水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表2可知，各因素對(duì)提取率的影響依次為料液比>酶反應(yīng)溫度>酶反應(yīng)pH>酶反應(yīng)時(shí)間。由此確定復(fù)合酶法提取金針菇總黃酮的最優(yōu)條件為A1B2C3D2，即料液比1∶20、酶反應(yīng)溫度60 ℃、酶反應(yīng)pH 5、酶反應(yīng)時(shí)間80 min。在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到金針菇總黃酮提取率為4.76%。

2.4 不同方法的對(duì)比研究

用設(shè)計(jì)中的3種方法提取金針菇總黃酮并測定金針菇總黃酮的提取率，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖6可知采用復(fù)合酶法所獲得的金針菇總黃酮提取率最高。

3 小結(jié)

本研究利用復(fù)合酶法提取金針菇總黃酮，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)金針菇總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。金針菇細(xì)胞內(nèi)成分復(fù)雜，除總黃酮外還含有其他的生物大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和纖維素等。這些物質(zhì)的存在無疑會(huì)影響到總黃酮的釋放。由于酶促反應(yīng)具有專一性、高效性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在試驗(yàn)中加入由纖維素酶和木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶體系，兩種酶的共同作用能夠有效降解細(xì)胞中蛋白質(zhì)、纖維素等雜質(zhì)，使黃酮類物質(zhì)更容易從細(xì)胞中釋放，從而提高了提取率[7]。同超聲波輔助法相比，復(fù)合酶法既減少了對(duì)提取物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的破壞，又由于在提取過程中溶劑用量很少，從而為后續(xù)的精制過程創(chuàng)造了有利條件。復(fù)合酶法提取金針菇總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶20，酶反應(yīng)時(shí)間80 min，酶反應(yīng)溫度60 ℃，酶反應(yīng)pH 5，在此條件下，金針菇總黃酮的提取率為4.76%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 申進(jìn)文，賈身茂.金針菇營養(yǎng)成分研究[J].中國食用菌，1997（5）：36-38.

[2] 龔盛昭.總黃酮類化合物保健食品大有開發(fā)價(jià)值[J].廣州食品工業(yè)科技，2004，18（1）：63-65.

[3] 萬 明，宋永鋼，楊 菠.黃酮類化合物的藥理作用及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].江西食品工業(yè)，2007（9）：46-49.

[4] 裴凌鵬，惠佰隸，金宗濂，等.黃酮類化合物的生理活性及其制備技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2004，25（2）：203-207.

[5] 朱會(huì)平.黃酮類化合物促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2006，17（3）：455-456.

[6] 方玉梅，張春生，譚 萍，等.金針菇總黃酮類化合物的抗氧化性作用[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：15-18.

[7] 張勝幫，葉 靜，陳 聰.復(fù)合酶酶法提取荷葉總黃酮類化合物的研究[J].食品科學(xué)，2012，33（22）：149-153.