李冬霞， 張 慧， 蔡松旺

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003，3中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院胸外科，廣東廣州510630)

肺癌占據(jù)人類惡性腫瘤發(fā)病率第一位，80% ～85%的肺癌是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)［1］。盡管外科手術(shù)技術(shù)的提高及影像設(shè)備、化療和放療等醫(yī)學(xué)手段的飛速發(fā)展，由于目前大多數(shù)患者就診時已是肺癌晚期，5年生存率仍然不到15%，治療效果欠佳［1］。

p21活化激酶(p21-activated kinase，PAK)是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白，含有可與Cdc42/Rac相互作用的CRIB區(qū)域［2］。PAK表達上調(diào)已在多種癌癥中報道，并在多種腫瘤細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等信號通路中起重要的作用［3-5］。PAK4最初當(dāng)作Cdc42受體被發(fā)現(xiàn)，具有調(diào)節(jié)細胞骨架重構(gòu)及絲狀偽足的功能［3］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)PAK4在胃癌、肝癌、乳腺癌、大腸癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中表達量上調(diào)，作為重要的癌基因促進腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移，抑制凋亡，成為PAK家族中研究最多和最熱門的一個基因［6］。然而，到目前為止，PAK4在非小細胞肺癌中的生物學(xué)作用尚不清楚。本文擬檢測PAK4在非小細胞肺癌細胞系及人組織中的表達水平，并分析其與臨床資料的相關(guān)性，探討PAK4的表達與非小細胞肺癌患者生存的關(guān)系。

材料和方法

1 一般資料

HBE、A549、NCI-H520、NCI-H460 和 NCI-H596細胞購于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心;選用中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院2012～2013年非小細胞肺癌手術(shù)新鮮切除標(biāo)本20例(10例原發(fā)性非小細胞肺癌和10例原發(fā)性非小細胞肺癌伴轉(zhuǎn)移，切除后標(biāo)本迅速放入液氮中)，2005～2009年非小細胞肺癌210例(所有患者術(shù)前均未行放、化療)。上述標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)生檢查驗證和歸類。

2 方法

2.1 Western blot實驗 利用10%的 SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，Ⅰ抗(1∶1 000)、Ⅱ抗(1∶1 000)孵育，發(fā)光檢測，GAPDH作為內(nèi)參照。使用Quantity One軟件進行定量分析。

2.2 實時熒光定量PCR實驗 按照一步法使用Invitrogen的TRIzol試劑來提取總RNA。使用Prime-Script RT Reagent Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。使用ABI 7900HT Fast Real-Time PCR體系來進行實時熒光定量PCR。PAK4的上游引物為5'-ATGTGGTGGAGATGTACAACAGCTA-3'，下游引物為5'-GTTCATCCTGGTGTGGGTGAC-3';內(nèi)參照U6的上游引物為 5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，下游引物為 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品采用滅菌雙蒸水，待測樣本按50 μL反應(yīng)體系進行，反應(yīng)條件為:93℃ 3 min預(yù)變性。然后93℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，40 個循環(huán)。

2.3 免疫組化實驗 所有組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、5 μm厚連續(xù)切片。PAK4抗體工作濃度為1∶50。應(yīng)用免疫組化SP法檢測PAK4蛋白的表達。根據(jù)染色范圍和染色強度來界定蛋白的表達情況，陽性范圍計分如下:＜10%記分為1分，10% ～35%記分為2分，35% ～70%記分為3分，＞70%記分為4分;染色強度計分如下:不染色為0分，弱染色1分，中度染色為2分，強染色為3分。蛋白表達最終得分=染色范圍×染色強度。兩項乘積≥6分為PAK4高表達，＜6分為PAK4低表達。

2.4 隨訪 通過電話及門診問詢隨訪，隨訪起始日期為手術(shù)時間，截止日期為2014年10月。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。A549、NCI-H520、NCI-H460 和 NCI-H596 細胞組與人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells，HBE細胞)對照組間的比較采用Dunnett-t檢驗;采用t檢驗比較20例新鮮非小細胞肺癌組織與相應(yīng)的癌旁組織中PAK4表達情況;采用χ2檢驗、Fisher精確概率法分析210例非小細胞肺癌患者PAK4蛋白表達與非小細胞肺癌生物學(xué)行為的關(guān)系;采用Kaplan-Meier法(log-rank檢驗)評估小細胞肺癌患者術(shù)后5年生存率;用Cox風(fēng)險比例模型分析PAK4與非小細胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PAK在非小細胞肺癌細胞及人支氣管上皮細胞中的表達

非小細胞肺癌細胞(A549、NCI-H520、NCI-H460和NCI-H596細胞)PAK4蛋白和mRNA表達均明顯高于HBE細胞(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.PAK4 protein and mRNA expression in the NSCLC cell lines.Mean±SEM.n=3～5.*P＜0.05 vs HBE.圖1 PAK4在非小細胞肺癌細胞中的表達

2 PAK在非小細胞肺癌組織及癌旁組織中的表達

20例非小細胞肺癌組織中PAK4蛋白及mRNA的表達明顯高于相應(yīng)的癌旁組織(P＜0.05)，10例原發(fā)性非小細胞肺癌伴轉(zhuǎn)移組PAK4的mRNA表達量明顯高于原發(fā)性非小細胞肺癌組(P＜0.05)，見圖2。

210 例非小細胞肺癌及癌旁組織免疫組化染色結(jié)果顯示，PAK4陽性顆粒位于細胞膜及細胞漿，非小細胞肺癌PAK4蛋白的陽性表達率為65.2%，PAK4蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(P＜0.01)。臨床資料分析示PAK4蛋白表達與非小細胞肺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P＜0.05)，見圖2、表1。

Figure 2.The expression of PAK4 and the association with the progression of NSCLC.A:Representative Western blots of PAK4 protein expression in the NSCLC tissues(T)and matched adjacent non-tumor tissues(N).Mean±SD.n=3.B:the mRNA expression of PAK4.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs non-tumor;#P＜0.05 vs without metastasis.C:representative immunohistochemical staining and the quantitative analysis of squamous-cell carcinoma and adenocarcinoma of human NSCLC tissues(T)and matched adjacent non-tumor tissues(N).Positive cells are stained brown(×40).Mean±SD.n=20.△P＜0.05 vs N.圖2 PAK4表達與非小細胞肺癌進展

表1 PAK4表達與非小細胞肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1.Correlation of PAK4 expression with clinicopathological variables in 210 cases of NSCLC

3 非小細胞肺癌患者的預(yù)后分析

PAK4蛋白高表達組患者的生存率低于PAK4蛋白低表達組患者(log-rank檢驗，P＜0.01)，采用Kaplan-Meier法做出患者的生存曲線如圖3所示;PAK4高表達組5年生存率為19%，PAK4低表達組5年生存率為45.2%。將單因素生存分析中得出的對非小細胞肺癌患者預(yù)后有顯著影響的因素(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化、臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移和PAK4蛋白表達)引入Cox回歸模型進行非小細胞肺癌預(yù)后的多因素分析，結(jié)果顯示PAK4蛋白表達是非小細胞肺癌患者的獨立預(yù)后因素，見表2。

Figure 3.Kaplan-Meier survival curve illustrated the prognostic significance of PAK4 expression in NSCLC.The patients were divided into high or low PAK4 expression groups according to the proportion of positively stained tumor cells and staining intensity.Five-year survival was calculated using the Kaplan-Meier method and analyzed using the log-rank test.圖3 非小細胞肺癌中PAK4表達相關(guān)的生存曲線

表2 非小細胞肺癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析Table 2.Univariate and multivariate analysis of factors associated with overall survival of patients with NSCLC

討 論

PAK4參與調(diào)節(jié)細胞骨架、細胞生長和細胞凋亡等多種生物學(xué)功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用［7-10］。目前已報道PAK4與乳腺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤有關(guān)。但是PAK4與非小細胞肺癌有關(guān)的報道較少，促使我們探討其是否在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中同樣起重要作用。

我們的研究結(jié)果表明，非小細胞肺癌細胞及非小細胞肺癌組織中PAK4均高表達，且PAK4高表達與非小細胞肺癌的臨床分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，并與非小細胞肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，提示PAK4可能同樣在非小細胞肺癌中起重要作用。

PAK4在不同腫瘤中可通過不同的信號通路影響腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移，如在絨毛膜癌中是通過下游的膜型基質(zhì)金屬蛋白1促進腫瘤細胞遷移及侵襲能力［7］;在卵巢癌中是通過下游的c-Src/絲裂原活化蛋白激酶激酶1(MEK1)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和MMP-2通路促進腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移［11］;在前列腺癌中是通過激活LIMK1/cofilin信號通路促進腫瘤細胞遷移［12］，在胃癌中通過調(diào)節(jié)SCG10或LIMK1/cofilin信號通路促進腫瘤轉(zhuǎn)移［9，13］。而PAK4在非小細胞肺癌中的生物學(xué)作用尚不清楚，我們將在下一步研究中探討，并對其機制進行深入研究，明確PAK4在非小細胞肺癌中的生物學(xué)作用，希望為非小細胞肺癌的治療提供新的靶點。

［1］ Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64(1):9-29.

［2］ Radu M，Semenova G，Kosoff R，et al.PAK signalling during the development and progression of cancer［J］.Nat Rev Cancer，2014，14(1):13-25.

［3］ Abo A，Qu J，Cammarano MS，et al.PAK4，a novel effector for Cdc42Hs，is implicated in the reorganization of the actin cytoskeleton and in the formation of filopodia［J］.EMBO J，1998，17(22):6527-6540.

［4］ 蔡松旺，謝迭來，翁毅敏，等.p21活化激酶6對人非小細胞肺癌A549細胞侵襲及遷移能力的影響［J］.中國病理生理雜志，2013，29(9):1637-1640.

［5］ 蔡松旺，李冬霞，安 軍，等.p21活化激酶6削弱非小細胞肺癌A549細胞侵襲及遷移能力的分子機制［J］.中國病理生理雜志，2014，30(1):67-71.

［6］ Dart AE，Wells CM.P21-activated kinase 4:not just one of the PAK［J］.Eur J Cell Biol，2013，92(4-5):129-138.

［7］ Lu W，Xia YH，Qu JJ，et al.p21-activated kinase 4 regulation of endometrial cancer cell migration and invasion involves the ERK1/2 pathway mediated MMP-2 secretion［J］.Neoplasma，2013，60(5):493-503.

［8］ Tabusa H，Brooks T，Massey AJ.Knockdown of PAK4 or PAK1 inhibits the proliferation of mutant KRAS colon cancer cells independently of RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT signaling［J］.Mol Cancer Res，2013，11(2):109-121.

［9］ Guo Q，Su N，Zhang J，et al.PAK4 kinase-mediated SCG10 phosphorylation involved in gastric cancer metastasis［J］.Oncogene，2014，33(25):3277-3287.

［10］ Mak GW，Chan MM，Leong VY，et al.Overexpression of a novel activator of PAK4，the CDK5 kinase-associated protein CDK5RAP3，promotes hepatocellular carcinoma metastasis［J］.Cancer Res，2011，71(8):2949-2958.

［11］ Siu MK，Chan HY，Kong DS，et al.p21-activated kinase 4 regulates ovarian cancer cell proliferation，migration，and invasion and contributes to poor prognosis in patients［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(43):18622-18627.

［12］ Ahmed T，Shea K，Masters JR，et al.A PAK4-LIMK1 pathway drives prostate cancer cell migration downstream of HGF［J］.Cell Signal，2008，20(7):1320-1328.

［13］ Li X，Ke Q，Li Y，et al.DGCR6L，a novel PAK4 interaction protein，regulates PAK4-mediated migration of human gastric cancer cell via LIMK1［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(1):70-79.